趙慧君，葛東穎，劉倩，吳競(jìng)，凌霞，張振東，郭壯*

(1.湖北文理學(xué)院 化學(xué)工程與食品科學(xué)學(xué)院 鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所，湖北 襄陽 441053；2.襄陽市食品藥品檢驗(yàn)所，湖北 襄陽 441021)

襄陽大頭菜歷史悠久，相傳為諸葛亮隱居襄陽隆中時(shí)所創(chuàng)，是我國四大名腌菜之一。在襄陽大頭菜發(fā)酵過程中，有些腌制池或缸表面會(huì)形成一層白色的生物膜，造成大頭菜的脆度明顯降低且產(chǎn)生刺激性氣味。一般認(rèn)為，這層白色的生物膜是由微生物群體和包裹菌體的基質(zhì)組成的聚合物[1]。近年來，對(duì)于引起發(fā)酵蔬菜腐敗的微生物研究也卓有成效，特別是在泡菜中的研究。蔡炯等發(fā)現(xiàn)細(xì)菌和酵母是四川腐敗泡菜中的主要微生物[2]。王猛等發(fā)現(xiàn)四川泡菜腐敗前后鹽濃度越低細(xì)菌多樣性越高[3]。何鵬暉等發(fā)現(xiàn)了 6株能夠在發(fā)酵蔬菜培養(yǎng)液表面形成膜醭的細(xì)菌，可能為發(fā)酵蔬菜形成腐敗膜醭的關(guān)鍵細(xì)菌和潛在威脅[4]。胡懷容等推斷芽孢桿菌和酵母可能是引起腌制大頭菜腐敗變質(zhì)的主要原因[5]。陳岑研究也證明芽孢桿菌可以引起泡菜的腐敗[6]。敖曉琳等也從不同的“生花”泡菜中分離出 4株細(xì)菌和 4 株酵母回接實(shí)驗(yàn)證明這8株菌均能引起泡菜不同程度的腐敗[7]。

變性梯度凝膠電泳(DGGE)是近幾年來在環(huán)境分子生態(tài)學(xué)研究中運(yùn)用非常多的一項(xiàng)技術(shù)。PCR-DGGE 最先由德國的Muyzer等應(yīng)用于微生態(tài)的研究，用這種方法能檢測(cè)出數(shù)量?jī)H占總?cè)郝?1% 的微生物。Danilo 等曾運(yùn)用 16S rRNA V3區(qū)擴(kuò)增片段結(jié)合 DGGE 技術(shù)，對(duì) 21 株參考菌株和分離自食品中的 34 株乳酸菌分別進(jìn)行了分析研究，并提出該方法可以用于食品中乳酸菌的分類。Ana Belén Flórez 等用 PCR-DGGE 技術(shù)和經(jīng)典分離鑒定方法對(duì) 4 批意大利傳統(tǒng)發(fā)酵干酪不同成熟階段的微生物多樣性進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，用 DGGE 發(fā)現(xiàn)了純培養(yǎng)未曾發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌。PCR-DGGE也廣泛應(yīng)用于傳統(tǒng)發(fā)酵類食品微生物群落結(jié)構(gòu)及其差異性，例如不同來源的郫縣豆瓣醬、不同原料四川泡菜、水果泡菜、印度尼西亞的扇貝等[8-14]。

目前還沒有針對(duì)襄陽大頭菜正常發(fā)酵腌制液和長(zhǎng)膜腌制液中細(xì)菌微生物多樣性比較的研究。本研究利用 PCR-DGGE 技術(shù)對(duì)不同發(fā)酵狀態(tài)下的襄陽大頭菜腌制液中的細(xì)菌多樣性進(jìn)行了分析，研究了細(xì)菌對(duì)大頭菜長(zhǎng)膜腌制液的貢獻(xiàn)，為后續(xù)襄陽大頭菜的工業(yè)化和標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)提供了一定的基礎(chǔ)，也可為其他腌菜類似的問題提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

聚丙烯酰胺、N,N-亞甲基二丙烯酰胺：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；D5625-01DNA提取試劑盒(Omega)、DNA Marker(Fermentas)、PCR清潔試劑盒(AXYGEN)：購于北京科博匯智生物科技發(fā)展有限公司；2×PCR mix：購于南京諾唯贊生物科技有限公司；rTaq、dNTP、pMD-18-T-Verctor：購于大連寶生物技術(shù)有限公司(TaKaRa)；PCR引物合成和測(cè)序：由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司完成。

1.1.2 儀器與設(shè)備

冷凍離心機(jī) 美國Beckman公司；PCR儀 美國Thermo Fisher公司；變性梯度凝膠電泳系統(tǒng) 美國Bio Red公司；電泳儀 北京六一儀器廠；凝膠成像儀 美國Protein Simple公司；掃描儀 上海中晶科技有限公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)樣品

本實(shí)驗(yàn)所用材料采集于襄陽孔明菜食品有限公司。分別在10個(gè)正常發(fā)酵大頭菜池和10個(gè)長(zhǎng)膜的大頭菜池里采集腌制液和生物膜，采集后低溫保存，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 宏基因組DNA的提取與檢測(cè)

采用Omega D5625-01試劑盒提取2種大頭菜腌制液10個(gè)樣品的宏基因組DNA，其中大頭菜長(zhǎng)膜腌制液是將膜和腌制液充分混勻后進(jìn)行DNA提取，并用0.8%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2 PCR

將提取的宏基因組濃度調(diào)整一致后作為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。正向引物為 ALL-GC-V3F(5'-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGCCCGGGGGCACCGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3')，反向引物為ALL-V3R(5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3')[15]，PCR擴(kuò)增體系為2.5 μL 10×PCR Buffer(含Mg2+)，2 μL dNTP(2.5 mol/L)，0.5 μL ALL-GC-V3F(10 mmol/L)，0.5 μL ALL-V3R(10 mmol/L)，0.5 μL rTaq(5 U/μL)，1 μL DNA模板，18 μL無菌水。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 4 min預(yù)變性，95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s， 72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸 10 min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL用 1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.3 DGGE及數(shù)據(jù)分析

采用變性劑線性梯度為 27%～60%，濃度為 8%(W/V)的聚丙烯酰胺濃度(40%丙烯酰胺/N,N-亞甲基二丙烯酰胺，W/W)凝膠進(jìn)行電泳，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物上樣量為 10 μL。電泳時(shí)，溫度為 60 ℃，先 120 V，78 min；后80 V，13 h。電泳結(jié)束對(duì)聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行銀染，用掃描儀采集凝膠電泳圖片，并用Quantity One 軟件分析圖片。

1.2.4 DGGE條帶的切割、克隆及測(cè)序

將DGGE膠上的優(yōu)勢(shì)條帶進(jìn)行切割后，用50 μL無菌水浸泡過夜后作為模板，用不含GC 夾子的引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序同上。擴(kuò)增結(jié)束后，瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)并用 PCR 清潔試劑盒進(jìn)行清潔，然后與 T-載體連接后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 TOP10 中，待長(zhǎng)出單菌落后鑒定陽性克隆，并將陽性克隆送往武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.5 測(cè)序產(chǎn)物的比對(duì)及進(jìn)化樹的構(gòu)建

將測(cè)序結(jié)果除去兩端載體的序列，然后利用 NCBI Blast 從 GenBank 數(shù)據(jù)庫中提取相似度比較高的相似的序列，用 MEGA 4.0 軟件制作系統(tǒng)發(fā)育樹，采 Neighbor-joining(鄰位相連法)制作系統(tǒng)進(jìn)化樹[16]，利用 Bootstrap(自展法)檢測(cè)制作的系統(tǒng)樹[17]，自展數(shù)據(jù)集為 1000 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 大頭菜腌制液中細(xì)菌16S rRNA V3區(qū)域擴(kuò)增產(chǎn)物DGGE圖譜分析

大頭菜正常腌制液和長(zhǎng)膜腌制液的DNA提取成功后，進(jìn)行細(xì)菌16S rRNA V3區(qū)域擴(kuò)增，擴(kuò)增片段大小180 bp左右，且無非特異性擴(kuò)增，可以用于DGGE。不同發(fā)酵狀態(tài) 10 個(gè)正常發(fā)酵大頭菜腌制液樣品(N-1～N-10)和10個(gè)長(zhǎng)膜大頭菜腌制液樣品(M-1～M-10)16S rRNA 擴(kuò)增產(chǎn)物的 DGGE 結(jié)果見圖1。

圖1 襄陽大頭菜正常發(fā)酵腌制液和長(zhǎng)膜腌制液的細(xì)菌 DGGE 圖譜Fig.1 DGGE chromatogram of bacteria in normal fermentation and biomembrane Xiangyang mustard root

DGGE圖譜中條帶的數(shù)量反映樣品中微生物的多樣性，條帶的亮度在一定程度上能反映菌種數(shù)量的多少?？梢钥闯?0個(gè)樣品經(jīng)DGGE后都分離出清晰的電泳條帶，說明電泳條件比較適合。由圖1可知，不同樣品間條帶幾乎沒有差異，只有編號(hào)4，5，6 的條帶在大頭菜長(zhǎng)膜腌制液的M-1，M-2，M-3，M-4，M-9和M-10樣品中亮度有所增加。

2.2 DGGE圖譜聚類分析

不同樣品間共有條帶數(shù)目的多少可以反映樣品間微生物群落結(jié)構(gòu)的相似性，采用 UPGMA 對(duì)樣品間微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行相似性評(píng)估。大頭菜正常腌制液和長(zhǎng)膜腌制液的細(xì)菌聚類分析見圖 2。

圖2 襄陽大頭菜正常發(fā)酵腌制液和長(zhǎng)膜腌制液的細(xì)菌聚類分析Fig.2 The cluster analysis of bacteria in normal fermentation and biomembrane Xiangyang mustard root

由圖2可知，初步將 20 個(gè)大頭菜腌制液樣品分為兩類，每類中大頭菜正常發(fā)酵腌制液與長(zhǎng)膜腌制液均混雜其中，可見分類與大頭菜的腌制液是否長(zhǎng)膜并無太大關(guān)系。由此推斷，細(xì)菌并不是引起大頭菜長(zhǎng)膜的主要因素。

2.3 DGGE條帶測(cè)序及同源性分析

對(duì)DGGE圖譜上的代表性亮帶進(jìn)行切膠、擴(kuò)增、克隆和測(cè)序，結(jié)果見表1。與NCBI上的模式菌株進(jìn)行比對(duì)并構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果見圖3。共對(duì)12個(gè)條帶進(jìn)行了測(cè)序，條帶對(duì)應(yīng)圖1中的編號(hào)。

表1 襄陽大頭菜正常發(fā)酵腌制液和長(zhǎng)膜腌制液的細(xì)菌 DGGE 條帶比對(duì)結(jié)果Table 1 Blast results of DGGE in normal fermentation and biomembrane Xiangyang mustard root

注：編號(hào)對(duì)應(yīng)圖1中的編號(hào)。

由表1可知，除1外，其余條帶的相似性與 NCBI中序列的相似性均在 99%～100%之間，說明鑒定具有意義。

圖3 基于16S rRNA構(gòu)建的襄陽大頭菜正常發(fā)酵腌制液和長(zhǎng)膜腌制液中細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rRNA sequences of normal fermentation and biomembrane Xiangyang mustard root

由圖1可知，編號(hào)為11的條帶為襄陽大頭菜鹵水中最具優(yōu)勢(shì)的菌株，測(cè)序結(jié)果為鹽單胞菌屬的細(xì)菌，可在含鹽0～32%的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，這與襄陽大頭菜腌制液中的高鹽環(huán)境是相一致的。從測(cè)序結(jié)果看，條帶7，8也為鹽單胞菌屬的細(xì)菌，由此可見，鹽單胞菌屬的細(xì)菌在大頭菜腌制液中細(xì)菌微生物中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。4，5，6 3個(gè)條帶在長(zhǎng)膜的腌制液中亮度有所增加，從它們的測(cè)序結(jié)果看關(guān)于這3個(gè)菌屬還沒有腐敗相關(guān)的報(bào)道。

3 討論

郭壯等利用 MiSeq 測(cè)序研究了襄陽大頭菜腌制液膜醭細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)菌株為Halomonas屬，Halanaerobim屬和Chromohalobacter屬細(xì)菌，這3種細(xì)菌占細(xì)菌總數(shù)量的50%以上[18]。本研究利用DGGE分析不同大頭菜不同發(fā)酵狀態(tài)的腌制液中細(xì)菌的多樣性，測(cè)序的12個(gè)條帶中有8個(gè)屬于這3個(gè)菌屬，說明這與MiSeq測(cè)序結(jié)果是一致的。這3個(gè)菌屬的細(xì)菌是腌制蔬菜中常見的和優(yōu)勢(shì)的菌屬。

本研究通過 DGGE 比較了襄陽大頭菜正常發(fā)酵腌制液與長(zhǎng)膜腌制液中細(xì)菌的異同，發(fā)現(xiàn)二者在細(xì)菌種類上基本相同，推測(cè)細(xì)菌不是引起襄陽大頭菜腌制液長(zhǎng)膜的主要原因。在泡菜中的研究表明，細(xì)菌和真菌都可能造成發(fā)酵液中長(zhǎng)膜，所以下一步的研究方向是揭示真菌對(duì)襄陽大頭菜長(zhǎng)膜的貢獻(xiàn)。