羅慶，李艷麗，唐詩(shī)淼，陳媛媛，周夢(mèng)舟，馮年捷，吳茜*

(1.湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院，武漢 430068；2．三峽食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，湖北 宜昌 443005；3.湖北工業(yè)大學(xué) 材料與化學(xué)學(xué)院，武漢 430068)

近年來(lái)，對(duì)食品加工中美拉德反應(yīng)的研究已經(jīng)變得熱門[1]。在食物的烹飪加熱過(guò)程中美拉德反應(yīng)對(duì)食品的色澤和風(fēng)味具有很大的影響，同時(shí)還有著負(fù)面作用，最不可忽視的是使蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值降低[2]。食醋中含有大量美拉德反應(yīng)所需的底物，同時(shí)生產(chǎn)過(guò)程中也具備了美拉德反應(yīng)所需的條件[3]，美拉德反應(yīng)可能也是醋液香味和色澤的一個(gè)重要來(lái)源?？寡趸瘎┯泻芎玫那宄杂苫鸵种艫GEs的能力[4]，從而減緩美拉德反應(yīng)，而兒茶素作為一種優(yōu)良的天然抗氧化劑，具有細(xì)胞調(diào)節(jié)和預(yù)防癌癥等多種功效[5]。

美拉德反應(yīng)主要指羰基化合物(還原糖類)和氨基化合物(氨基酸和蛋白質(zhì))之間的反應(yīng)[6]，其終產(chǎn)物之一是晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)。蛋白質(zhì)糖基化產(chǎn)生AGEs的病理作用已被許多研究報(bào)道[7]，AGEs不僅可以直接影響細(xì)胞和組織功能，參與糖尿病并發(fā)癥、老化過(guò)程及動(dòng)脈粥樣硬化等疾病的發(fā)生發(fā)展，也可以通過(guò)與受體特異性結(jié)合，激發(fā)信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)改變蛋白質(zhì)和細(xì)胞功能，從而導(dǎo)致病變[8]。

本文探究了兒茶素對(duì)不同種類食醋在不同時(shí)間段的總酚、色率、AGEs抑制率和食醋內(nèi)揮發(fā)性成分的變化，間接評(píng)估了兒茶素減緩美拉德反應(yīng)發(fā)生的程度，為防止食醋在儲(chǔ)藏過(guò)程中有害物質(zhì)的增加和提高食醋品質(zhì)安全奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

不同食醋原樣(白醋、米醋、蘋果醋、橘子醋、西瓜醋、魔芋醋、固態(tài)發(fā)酵醋)：購(gòu)于淘寶天貓超市；福林酚試劑：上海源葉生物科技有限公司；琥珀酸、碳酸鈉、甘氨酸、木糖、二辛醇：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；沒食子酸：五峰赤誠(chéng)生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外可見分光光度計(jì) 北京瑞麗分析儀器有限公司；AR323CN型電子天平 奧豪斯儀器(上海)有限公司；pH計(jì) 雷磁-上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；F-7000型熒光分光光度計(jì) 日立高新技術(shù)有限公司；7200型安捷倫氣相色譜/四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀 上海百賀儀器科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 不同食醋樣品和模擬醋樣的制備

取8組5 mL不同食醋樣分別加入到15 mL的離心管中，分別加入濃度為0.01，0.05，0.1，0.2，0.4，0.8，1.0 mg/mL的兒茶素1 mL，并用蒸餾水代替兒茶素為對(duì)照組，搖勻，放置于50 ℃恒溫培養(yǎng)箱。

準(zhǔn)確稱取甘氨酸6.0056 g和木糖12.0104 g(摩爾比為1∶1)，分別用pH為3.5的琥珀酸緩沖液定容至100 mL，準(zhǔn)確稱取兒茶素100 mg，琥珀酸緩沖液定容至100 mL,配制成兒茶素濃度為1.0 mg/mL。根據(jù)需要梯度稀釋成濃度為0.8，0.4，0.2，0.1，0.05，0.01 mg/mL的兒茶素溶液，取0.8 mol/L的甘氨酸4 mL，0.8 mol/L的木糖4 mL，加入2 mL兒茶素溶液，配制成10 mL的反應(yīng)液，設(shè)置pH為3.5的琥珀酸緩沖液替代兒茶素作為對(duì)照組，搖勻，放置于50 ℃。

1.3.2 總酚的測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確稱取一水合沒食子酸0.100 g，用蒸餾水溶解后冷卻定容至100 mL容量瓶中備用，此標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度即為1000 mg/L。用移液管分別從此標(biāo)準(zhǔn)溶液中吸取0，0.5，1.0，1.5，2.0 mL到50 mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋定容后分別得到0，10，20，30，40，50 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。依次量取系列稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)溶液各0.5 mL，然后加入稀釋5倍的福林酚試劑5 mL的水，搖勻，靜置3 min，依次加入15%的碳酸鈉2 mL，加入蒸餾水定容至10 mL，避光顯色1 h后，在760 nm的波長(zhǎng)下測(cè)定系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[9]。得總酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=9.1143x+0.0416，R2=0.9984。

量取稀釋若干倍的樣液0.5 mL，按照制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法依次加樣，避光顯色1 h后，在760 nm的波長(zhǎng)下測(cè)定樣品溶液的吸光值。

1.3.3 色率的測(cè)定[10]

將待測(cè)醋液離心后(4000 r/min，10 min)得澄清醋液，將其稀釋5倍，取適量移入1 cm的石英比色皿中，用分光光度計(jì)于610 nm處測(cè)定其光密度值，以蒸餾水作為空白，按下式計(jì)算EBC色率，其中EBC意義在于：當(dāng)610 nm處光密度為0.076時(shí)，設(shè)定為20000 EBC單位。

注：A610 nm表示樣品在波長(zhǎng)為610 nm處的吸光度。

1.3.4 AGEs抑制率的測(cè)定

AGEs大多具有熒光性，可通過(guò)熒光法檢測(cè)其含量。激發(fā)波長(zhǎng)370 nm，發(fā)射波長(zhǎng)440 nm，分別測(cè)定真實(shí)醋樣和模擬醋樣稀釋20倍后，相同溫度50 ℃下，放置2，5，10，15天的各個(gè)樣液中的熒光強(qiáng)度的變化值以及添加不同濃度的兒茶素后的抑制率。

1.3.5 食醋中揮發(fā)性物質(zhì)的測(cè)定

1.3.5.1 樣品預(yù)處理

先將萃取頭裝入手柄，插入250 ℃氣相色譜進(jìn)樣口老化40 min至無(wú)雜峰。分別將醋樣用無(wú)菌蒸餾水稀釋到酸度為4 g，統(tǒng)一酸度。稱取10 mL原醋樣和10 mL醋樣與兒茶素的混合液(體積比為9∶1)，兒茶素濃度為0.2 mg/mL，加入到20 mL頂空微萃取樣品瓶中，放入轉(zhuǎn)子，加入40 μL提前配好的二辛醇稀釋液，蓋上蓋子，插入萃取頭，固定在50 ℃磁力攪拌恒溫水浴鍋內(nèi)，平衡20 min后推下纖維頭繼續(xù)萃取20 min，然后收起纖維頭，拔下萃取頭，插入氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀的氣相色譜進(jìn)樣口，推下纖維頭，于250 ℃解吸4 min，抽回纖維頭后拔出萃取頭，同時(shí)啟動(dòng)儀器采集數(shù)。

1.3.5.2 儀器條件[11]

色譜條件：色譜柱，DB-WAX毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；通入保護(hù)氣氦氣(He)；流速：0.9 mL/min；進(jìn)樣口溫度：250 ℃，不分流。程序柱溫：起始溫度40 ℃，5 min。階段一：以4 ℃/min升溫至120 ℃，運(yùn)行25 min。階段二：以8 ℃/min升溫至200 ℃，保持5 min，運(yùn)行40 min后至260 ℃。

質(zhì)譜條件：電子離子(electronionization，EI)；接口溫度280 ℃，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，電子能量70 eV，質(zhì)量掃描范圍33～450 amu。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度兒茶素對(duì)食醋中總酚含量的影響

以不加兒茶素的原醋樣作對(duì)照組，隨著所添加兒茶素濃度的增大，不同品種的食醋中總酚的含量均會(huì)增大；隨放置天數(shù)的增加，白醋、蘋果醋等6種醋樣中總酚含量變化不太明顯，固態(tài)發(fā)酵醋原樣變化最為明顯[12，13]，在50 ℃條件下放置2天后，其總酚含量從0.335 mg/mL增長(zhǎng)到1.107 mg/mL，且2天后，隨著放置天數(shù)的增加，固態(tài)發(fā)酵醋中的總酚含量增長(zhǎng)減緩。由于發(fā)酵方式的不同[14]，固態(tài)發(fā)酵填充物(例如麩皮)中含有些許多酚、黃酮、VE等具有抗氧化功效的成分，這些物質(zhì)在醋酸發(fā)酵的過(guò)程中被溶出，增強(qiáng)其抗氧化活性，這與羅秀麗等人的研究成果一致[15]。不同食醋中添加不同濃度的兒茶素的總酚測(cè)定結(jié)果見表1。

表1 不同濃度的兒茶素對(duì)不同食醋中總酚含量的影響

續(xù) 表

2.2 不同濃度兒茶素對(duì)食醋中色率的影響

醬油、食醋等發(fā)酵制品在發(fā)酵過(guò)程中會(huì)發(fā)生美拉德反應(yīng)，顏色會(huì)加深[16]。由表1可知，白醋、米醋、蘋果醋使用方法1.3.3測(cè)定的值較小，說(shuō)明以上3組醋液在放置的過(guò)程中發(fā)生的美拉德反應(yīng)程度較弱，加入不同濃度的兒茶素后，對(duì)其美拉德反應(yīng)抑制效果不明顯，且部分醋液運(yùn)用方法1.3.3難以準(zhǔn)確檢測(cè)其美拉德反應(yīng)發(fā)生程度。從橘子醋、西瓜醋、魔芋醋和固態(tài)發(fā)酵醋的數(shù)據(jù)可以看出，隨著放置天數(shù)的增加，原樣醋中的色率會(huì)增加，這說(shuō)明醋液在50 ℃下能夠加速其美拉德反應(yīng)的發(fā)生。

表2 不同濃度兒茶素對(duì)不同食醋中色率值的影響

續(xù) 表

注：ND表示未檢出。

由表2可知，隨著不同濃度兒茶素的加入，加入了兒茶素的醋樣中的色率值遠(yuǎn)小于原樣值，這說(shuō)明加入了兒茶素的醋樣中美拉德反應(yīng)的發(fā)生程度減弱，同時(shí)，通過(guò)色率的測(cè)定，可以得出兒茶素能夠抑制美拉德反應(yīng)的產(chǎn)生，且隨著加入的兒茶素濃度的增大，抑制效果越好。

2.3 不同濃度兒茶素對(duì)AGEs的抑制效果

2.3.1 不同濃度兒茶素對(duì)模擬醋液中AGEs的抑制效果

不同濃度兒茶素添加到模擬醋液中，對(duì)其熒光性AGEs的抑制率的影響，見圖1。

圖1 不同濃度兒茶素對(duì)模擬醋液中AGEs的抑制率變化

在相同的放置溫度下，隨著兒茶素濃度的增加，相對(duì)抑制率亦增加；隨著放置天數(shù)的增加，相對(duì)抑制率亦增加。對(duì)比參照2.3.2中數(shù)據(jù)可以看出，放置相同的溫度和時(shí)間，在添加相同濃度的兒茶素的條件下，模擬醋液的抑制效果均高于真實(shí)醋液。這說(shuō)明按醋液中還原糖和氨基氮配制的醋液模擬液在50 ℃條件下，能較大程度發(fā)生美拉德反應(yīng)，產(chǎn)生晚期糖基化終末產(chǎn)物；間接說(shuō)明真實(shí)醋液中可能存在能夠加速美拉德反應(yīng)的因子，即在真實(shí)醋液中美拉德反應(yīng)更容易發(fā)生。

2.3.2 不同濃度兒茶素對(duì)真實(shí)食醋樣中AGEs的抑制效果

圖2 不同濃度兒茶素對(duì)白醋中AGEs的抑制率變化

圖3 不同濃度兒茶素對(duì)米醋中AGEs的抑制率變化

圖4 不同濃度兒茶素對(duì)蘋果醋中AGEs的抑制率變化

圖5 不同濃度兒茶素對(duì)橘子醋中AGEs的抑制率變化

圖6 不同濃度兒茶素對(duì)西瓜醋中AGEs的抑制率變化

圖7 不同濃度兒茶素對(duì)魔芋醋中AGEs的抑制率變化

圖8 不同濃度兒茶素對(duì)固態(tài)發(fā)酵醋中AGEs的抑制率變化

由圖2～圖8可知不同濃度的兒茶素對(duì)不同種類的食醋中熒光性AGEs的抑制效果。在相同的放置溫度(50 ℃)下，隨著兒茶素濃度的增加，每種食醋中的相對(duì)抑制率亦增加。隨著放置天數(shù)的增加，各個(gè)濃度的兒茶素對(duì)食醋中熒光性AGEs的抑制效果增加。白醋、米醋等4種醋樣在添加濃度為0.8，1.0 mg/mL的兒茶素后，放置10，15天后對(duì)食醋中熒光性AGEs的抑制效果達(dá)到了90%左右；部分食醋在放置10天后，抑制率開始有些許的下降，這是由于放置過(guò)程中食醋樣品發(fā)生了返渾的現(xiàn)象[17]。返渾可能造成的原因有生物性返渾(主要有嗜酸耐熱芽孢桿菌屬、葡萄桿菌屬等)和非生物性返渾(非生物因素有蛋白質(zhì)、還原糖和單寧等)，這些因素會(huì)加劇美拉德發(fā)生的發(fā)生。

2.4 不同濃度兒茶素對(duì)食醋中揮發(fā)性物質(zhì)的影響

表3 GC-MS分析兒茶素對(duì)橘子醋中揮發(fā)性成分的影響

續(xù) 表

注：ND表示未檢出。

由表3可知，從橘子醋原樣液中共鑒定出了21種成分，即酸類5種、醇類3種、酯類4種、醛類1種、酮類1種、其他物質(zhì)7種；從橘子醋與兒茶素的混合液中共鑒定出22種成分，即酸類4種、醇類4種、酯類3種、醛類2種、酮類1種、其他物質(zhì)8種。測(cè)定的2組樣液中均含有的酸類有3種(乙酸、異戊酸、琥珀酸)、醇類2種(乙醇、3-丁炔-1-醇)、酯類2種(2-甲基丁基乙酸酯、乙酸苯乙酯)、其他物質(zhì)4種(三甲基吡嗪、庚烷、甲酰肼、二甲酰肼)，其中添加兒茶素組中的乙酸含量為37.658%，大于原醋樣中30.196%的乙酸含量，說(shuō)明兒茶素的添加可能促進(jìn)食醋中乙酸的生成；隨著兒茶素的添加，食醋中酯類物質(zhì)均增加，其中2-甲基丁基乙酸酯的含量由4.326%增長(zhǎng)至14.027%，乙酸苯乙酯的含量由0.238%增長(zhǎng)至0.541%，而酯類物質(zhì)是醋液中揮發(fā)性香味成分的主要來(lái)源[18]，包括乙酸異戊酯、乙酸乙酯、苯甲酸乙酯等均是其揮發(fā)性香味的主要構(gòu)成成分[19]，間接說(shuō)明兒茶素的添加可能促進(jìn)食醋中香味的產(chǎn)生；兒茶素的添加，減少了糠醇向糠醛的轉(zhuǎn)化，而醛類物質(zhì)是產(chǎn)生AGEs的前體物質(zhì)，間接說(shuō)明食醋中AGEs的含量減少，提高了食醋的質(zhì)量安全品質(zhì)。

3 討論

食醋的生產(chǎn)原料中含有大量能夠促進(jìn)美拉德反應(yīng)的反應(yīng)物，也滿足美拉德反應(yīng)的條件，因此食醋在生產(chǎn)過(guò)程中發(fā)生美拉德反應(yīng)是可能的，這也是影響食醋營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和色澤的一個(gè)重要因素。通過(guò)測(cè)定真實(shí)醋液與模擬醋液中食醋中AGEs的含量及抑制率，說(shuō)明食醋中存在的大量還原糖和蛋白質(zhì)使得食醋在儲(chǔ)藏過(guò)程中發(fā)生了美拉德反應(yīng)，而模擬醋液的抑制效果更好，則表明真實(shí)食醋中還存在著其他能夠促進(jìn)美拉德反應(yīng)的因子。

兒茶素作為一種天然的抗氧化劑，添加不同濃度到模擬醋液與真實(shí)醋液中，得出：隨著兒茶素濃度的增加，食醋液中的總酚含量也增加，且與濃度呈正相關(guān)；食醋液中的色率會(huì)降低，說(shuō)明兒茶素能夠抑制食醋在儲(chǔ)藏過(guò)程中美拉德反應(yīng)的發(fā)生；通過(guò)對(duì)比模擬醋液與真實(shí)醋液中兒茶素對(duì)AGEs的抑制效果，得出兒茶素能夠抑制食醋中AGEs的產(chǎn)生，且抑制效果與兒茶素濃度呈正相關(guān)性；兒茶素的添加，使得食醋中的部分酸類和酯類的含量增加，而酸類與酯類正是食醋中風(fēng)味與呈味物質(zhì)的重要組成物質(zhì)，間接表明兒茶素的添加能夠促進(jìn)食醋風(fēng)味物質(zhì)與呈味物質(zhì)的產(chǎn)生，同時(shí)也減少糠醇向糠醛的轉(zhuǎn)化，而醛類物質(zhì)是產(chǎn)生AGEs的前體物質(zhì)，間接說(shuō)明兒茶素的添加能夠減少AGEs的產(chǎn)生，保證食醋儲(chǔ)藏過(guò)程中的安全和品質(zhì)。