林冬融，揭育東，韓江全

(1.遵義醫(yī)學(xué)院第五附屬(珠海)醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，廣東 珠海 519100；2.遵義醫(yī)學(xué)院第五附屬(珠海)醫(yī)院 急診科，廣東 珠海 519100)

腦梗死是中老年人的常見病及多發(fā)病，其致殘率高，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。細(xì)胞凋亡已被公認(rèn)是腦梗死眾多發(fā)病機(jī)制中的重要一環(huán)，以凋亡為主要病理變化的腦缺血半暗帶面積大小決定著患者預(yù)后。而近年來眾多報(bào)道均表明，細(xì)胞凋亡亦是糖尿病加重腦缺血再灌注損傷的重要機(jī)制之一[1-2]。尤瑞克林是我國科研工作者研發(fā)的一種治療急性缺血性腦血管病藥物，它可以選擇性擴(kuò)張缺血區(qū)腦血管、減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷、抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡、促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)再生[3]。本實(shí)驗(yàn)通過模擬糖尿病大鼠腦缺血再灌注損傷的病理生理過程，探討尤瑞克林對糖尿病合并急性腦缺血再灌注損傷神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組 健康雄性SD大鼠82只，8周齡，體重250～300 g，廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。所有大鼠隨機(jī)分為3大組：(1)尤瑞克林治療組(簡稱尤瑞克林組)：36只；(2)缺血組：36只；(3)假手術(shù)組：10只。前兩組再隨機(jī)分為腦缺血2 h再灌注12 h、24 h、48 h三個亞組，每個亞組12只動物。

1.2 藥物與試劑 鏈脲佐菌素(Sigma公司)、Cyt-C Rabbit mAb及caspase-3 Rabbit mAb(武漢博士德生物工程有限公司)、S-P超敏試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)、DAB顯色試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)、TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)、注射用尤瑞克林(廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 微機(jī)血糖儀(美國雅培公司)、MiVnT 顯微生物圖像分析系統(tǒng)(廣東珠海微宇公司)、XMTB數(shù)顯溫控儀(浙制02810215)、培養(yǎng)/干燥箱PH030A(上海一恒科技有限公司)、Leica DM LB2光學(xué)顯微鏡(德國)。

1.4 方法

1.4.1 糖尿病模型制作 所有SD大鼠均在實(shí)驗(yàn)前8 h禁食，6 h禁水。在術(shù)前30 min新鮮配制濃度為5 mg/mL的無菌鏈脲佐菌素(STZ)。常規(guī)消毒后，以2 mg/100 g在大鼠左下腹腔注射STZ，于24 h以3.5 mg/100 g再次注射STZ。術(shù)后自由進(jìn)水進(jìn)食。7 d后以微機(jī)血糖儀測定大鼠尾尖外周血血糖，選取非空腹血糖16.7～25.6 mmol/L的大鼠作為本次實(shí)驗(yàn)糖尿病大鼠模型。

1.4.2 MCAO/R大鼠模型 參照Zea-longa法[4]制作。將實(shí)驗(yàn)大鼠固定，于右側(cè)頸部作一縱向切口，分離頸總動脈(上至同側(cè)頸外動脈)，結(jié)扎頸總動脈近心端，并于頸總動脈與頸外動脈分叉處結(jié)扎頸外動脈。于頸總動脈近心端結(jié)扎處放一絲線，暫不收緊，在絲線與結(jié)扎處之間的血管壁作一切口，插入一線身直徑0.26 mm，線頭直徑0.36 mm的成品栓線至頸內(nèi)動脈，有阻力感后停止，收緊預(yù)置絲線以固定后消毒及逐層縫合。假手術(shù)組按上述步驟切開及分離頸總動脈、頸外動脈后重新縫合皮膚，不切開血管插入栓線。術(shù)后2 h，將手術(shù)縫合口處栓線外露殘端抽出至有阻力感，說明栓線頭端已退回至頸總動脈。尤瑞克林組用滅菌0.9%氯化鈉溶液稀釋為8.75×10-3PNA 單位/kg，給藥量1 mL/kg，于再灌后30 min經(jīng)舌下靜脈給藥。缺血組于同樣時(shí)間給予等量生理鹽水。假手術(shù)組不注射。將大鼠放入鼠籠中飼養(yǎng)，自由飲食，室溫保持在25 ℃，按相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)(12、24、48 h)處死動物，斷頭取腦，固定、脫水、透明、包埋。

1.4.3 神經(jīng)功能評分 分別于再灌注12、24、48 h各個時(shí)間點(diǎn)處死動物前進(jìn)行神經(jīng)功能評分：評分標(biāo)準(zhǔn)按照Bederson[5]6級5分制。0分：無神經(jīng)功能缺損，1分：對側(cè)上肢不能完全伸展，2分：對側(cè)肢體抵抗力下降，3分：提尾時(shí)向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈，4分：行走時(shí)自動轉(zhuǎn)圈，5分：對刺激無反應(yīng)，無自發(fā)性活動。評分為2分及2分以上表示模型成功，分?jǐn)?shù)越高，則神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。

1.4.4 凋亡細(xì)胞數(shù)檢測 采用原位缺口末端標(biāo)記法(TUNEL法)檢測細(xì)胞凋亡數(shù)目，嚴(yán)格按照細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作。細(xì)胞核有凋亡形態(tài)學(xué)特征并有棕黃色顆粒者為陽性凋亡細(xì)胞。隨機(jī)選取缺血半暗帶區(qū)內(nèi)5個不相重復(fù)的視野，計(jì)算陽性凋亡細(xì)胞數(shù)目，取其平均值用于各組間統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。

1.4.5 Cyt-C及caspase-3表達(dá)檢測 免疫組織化學(xué)采用S-P法。具體操作嚴(yán)格按照免疫組化檢測試劑盒(S-P法)說明書進(jìn)行，Ⅰ抗分別為Cyt-C Rabbit mAb及caspase-3 Rabbit mAb。細(xì)胞胞漿呈棕黃色者為陽性細(xì)胞。以MiVnT顯微生物圖像分析系統(tǒng)對圖片進(jìn)行分析，平均灰度級表示圖像的透光率，平均灰度級數(shù)值越低，說明圖片透光率越低，染色越深，陽性率越高。取平均灰度級的算術(shù)均數(shù)用于各組間統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。

2 結(jié)果

2.1 造模前大鼠尾尖外周血血糖測定 造模前假手術(shù)組血糖值(21.11±1.70) mmol/L，缺血組血糖值為(21.09±2.67)mmol/L，尤瑞克林組血糖值為(20.72±2.78)，三組間血糖值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 神經(jīng)功能評分 假手術(shù)組大鼠神經(jīng)功能評分均為0分，未見神經(jīng)功能缺損，其余兩組大鼠出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)，與假手術(shù)組相比差異顯著(P<0.01)。其中，缺血組及尤瑞克林組的神經(jīng)評分表現(xiàn)為隨時(shí)間的延長逐漸增高，24 h達(dá)到最高；尤瑞克林組的神經(jīng)評分均低于相同時(shí)點(diǎn)缺血組(P<0.05，見表1)。

表1 各組神經(jīng)功能評分比較

2.3 凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù) 假手術(shù)組可見少量凋亡細(xì)胞，其余兩組大鼠缺血半暗帶中均可見大量凋亡細(xì)胞，與假手術(shù)組相比差異顯著(P<0.01)。缺血組和尤瑞克林組的細(xì)胞凋亡數(shù)隨時(shí)間的延長逐漸增高，24 h達(dá)到最高；尤瑞克林組的凋亡細(xì)胞數(shù)均低于相同時(shí)點(diǎn)缺血組(P<0.05)，見表2，圖1。

表2 各組凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)比較

A:假手術(shù)組;B:缺血組12 h;C:缺血組24 h;D:缺血組48 h;E:尤瑞克林組12 h;F:尤瑞克林組24 h;G:尤瑞克林組48 h；細(xì)胞核內(nèi)有棕黃色顆粒為TUNEL染色陽性細(xì)胞，細(xì)胞胞核呈藍(lán)色為正常細(xì)胞。

2.4 免疫組化檢測Cyt-C及caspase-3表達(dá) 假手術(shù)組Cyt-C及caspase-3表達(dá)極低，缺血組及尤瑞克林組Cyt-C及caspase-3表達(dá)隨再灌注時(shí)間延長逐漸增加，于24 h達(dá)高峰，Cyt-C表達(dá)強(qiáng)度隨后逐漸降低，而caspase-3于48 h后表達(dá)仍處于高水平，無明顯下降，該兩組平均灰度級與假手術(shù)組相比，存在顯著差異(P<0.01)。其中，尤瑞克林組的Cyt-C及caspase-3表達(dá)水平均顯著低于相同時(shí)間點(diǎn)缺血組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，見表3圖2和表4圖3。

表3 Cyt-C免疫組化灰度級比較

A:假手術(shù)組;B:缺血組12 h;C:缺血組24 h;D:缺血組48 h;E:尤瑞克林組12 h;F:尤瑞克林組24 h;G:尤瑞克林組48 h；細(xì)胞漿染成棕黃色者為陽性細(xì)胞；細(xì)胞結(jié)構(gòu)較為完整，胞核呈藍(lán)色者為正常細(xì)胞。

表4 Caspase-3免疫組化灰度級比較

A:假手術(shù)組;B:缺血組12 h;C:缺血組24 h;D:缺血組48 h;E:尤瑞克林組12 h;F:尤瑞克林組24 h;G:尤瑞克林組48 h；細(xì)胞漿染成棕黃色者為陽性細(xì)胞；細(xì)胞結(jié)構(gòu)較為完整，胞核呈藍(lán)色者為正常細(xì)胞。

3 討論

隨著人類生活水平提高，糖尿病已成為中老年患者的常見慢性病，同時(shí)，糖尿病也是缺血性腦血管病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，患者的血糖越高，發(fā)生急性腦梗死后腦損傷的程度越重，預(yù)后更差[6]。國內(nèi)外相關(guān)研究證實(shí)[1-2]，細(xì)胞凋亡在高血糖加重腦缺血再灌注損傷的眾多機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用，而線粒體途徑則是3條經(jīng)典的細(xì)胞凋亡途徑之一[7-8]。研究認(rèn)為[9]，線粒體作為為機(jī)體提供直接能量來源的細(xì)胞器，在細(xì)胞凋亡過程中亦扮演著重要角色。Cyt-C是一種由核基因編碼的水溶性蛋白，而caspase-3則是一組具有相似的氨基酸順序、二級結(jié)構(gòu)的半胱氨酸蛋白酶，二者均系線粒體內(nèi)重要的凋亡相關(guān)性因子，參與調(diào)節(jié)線粒體的代謝[10-11]。急性腦缺血再灌注發(fā)生后，在各種病理因素的刺激下，線粒體內(nèi)膜上的非特異性通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔(the permeability transition pore，PTP)的通透性增加并開放[12]，促使Cyt-C從線粒體內(nèi)通過PTP釋放入胞漿，與生理?xiàng)l件下無活性的caspase-9的前體相結(jié)合，使caspase-9活化，后者可進(jìn)一步激活下游的caspase-3，引發(fā)caspase級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，因此，Cyt-C是細(xì)胞凋亡扳機(jī)點(diǎn)，而caspase-3則是下游的執(zhí)行者[13-14]。新近研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞色素C1亞基2和NDUFS2可能與心肌缺血再灌注損傷有關(guān)[15]。在本課題組前期有關(guān)糖尿病加重腦缺血再灌注損傷的細(xì)胞凋亡途徑研究中，通過對比正常血糖組及高血糖組大鼠腦缺血再灌注后Cyt-C表達(dá)的變化發(fā)現(xiàn)，對比正常血糖組，高血糖組大鼠腦缺血半暗帶中Cyt-C及caspase-3的表達(dá)顯著增強(qiáng)，提示高血糖可加重腦缺血再灌注后腦神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，而Cyt-C及caspase-3的激活及表達(dá)增強(qiáng)可能是糖尿病加重腦缺血再灌注損傷的機(jī)制之一[16]。

尤瑞克林即人尿激肽原酶，是我國科研工作者研發(fā)的一種治療急性缺血性腦血管病藥物，是從人類尿液中提取的絲氨酸蛋白酶，能催化激肽原水解產(chǎn)生激肽，后者及其進(jìn)一步降解產(chǎn)物能與缺血部位血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的 B1 受體結(jié)合發(fā)揮擴(kuò)張微動脈的作用。因B1受體僅在組織受缺血損傷后由損傷的組織血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)生成，故尤瑞克林可選擇性地?cái)U(kuò)張缺血區(qū)腦血管，從而提高缺血腦組織血流量，改善腦組織對氧的攝取[17-20]。近年來多項(xiàng)研究顯示，尤瑞克林的腦保護(hù)作用與多個凋亡相關(guān)因子有著密切關(guān)系，可通過上調(diào)Bcl-2表達(dá)，下調(diào)Caspase-3、Fas-L蛋白、Bax蛋白表達(dá)，抑制p38MAPK活化等，從而抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)再生[21-24]，改善神經(jīng)功能缺損癥狀[25]。經(jīng)《中國急性缺血性腦卒中診治指南(2010年版)》推薦用于缺血性腦血管病急性期治療[26]。同時(shí)，在臨床療效觀察中，對急性腦梗死合并2型糖尿病患者采用美國國立衛(wèi)生研究院腦卒中量表(NIHSS評分)、改良RankinScale(mRS評分)及日常生活能力量表(ADL評分)評定尤瑞克林治療組和對照組兩組患者療效，證明尤瑞克林治療2型糖尿病并發(fā)急性腦梗死療效顯著[27-28]，但其保護(hù)機(jī)制尚未明確。

在本實(shí)驗(yàn)的糖尿病大鼠中，缺血組及尤瑞克林組的神經(jīng)功能評分表現(xiàn)為隨時(shí)間的延長逐漸增高，24 h達(dá)到最高，且尤瑞克林組在各個時(shí)點(diǎn)的評分低于缺血組(P<0.05)，說明尤瑞克林對糖尿病大鼠腦缺血再灌注后的神經(jīng)功能缺損具有保護(hù)作用，與上述尤瑞克林治療2型糖尿病并發(fā)急性腦梗死臨床療效觀察結(jié)果相一致。凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果亦提示缺血組和尤瑞克林組的細(xì)胞凋亡數(shù)隨時(shí)間的延長逐漸增高，24 h達(dá)到最高，尤瑞克林組各個時(shí)點(diǎn)的凋亡細(xì)胞數(shù)明顯低于缺血組(P<0.05)，說明尤瑞克林對糖尿病大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)機(jī)制可能是通過抑制缺血半暗帶中的神經(jīng)細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)。本研究還通過免疫組化檢測Cyt-C及caspase-3表達(dá)發(fā)現(xiàn)，缺血組及尤瑞克林組Cyt-C及caspase-3表達(dá)隨再灌注時(shí)間延長逐漸增加，于24 h 達(dá)高峰，隨后逐漸降低，而caspase-3于48 h后表達(dá)仍處于高水平，無明顯下降，與腦缺血后半暗帶區(qū)Cyt-C及caspase-3表達(dá)時(shí)相變化的研究相一致[29-31]，而尤瑞克林組各個時(shí)間點(diǎn)的Cyt-C及caspase-3表達(dá)水平均顯著低于缺血組(P<0.05)。結(jié)合上述研究結(jié)果，我們得出如下結(jié)論：尤瑞克林對糖尿病大鼠局灶性腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的抑制作用可能是通過下調(diào)Cyt-C及caspase-3表達(dá)實(shí)現(xiàn)。