董煥嫦 黃春秀 李 揚(yáng)

(1. 華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州市亞熱帶生物多樣性與環(huán)境生物監(jiān)測重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510631; 2. 華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東省水產(chǎn)健康安全養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510631)

擬菱形藻屬(Pseudo-nitzschiaPeragallo)物種是全球近岸水域廣布的浮游硅藻, 因部分物種能夠產(chǎn)生記憶缺失性貝毒(Amnesic Shellfish Poisoning,ASP)—多莫酸(Domoic acid, DA)而備受關(guān)注[1,2]。目前全球已報道49個擬菱形藻物種, 其中26種能夠產(chǎn)生多莫酸[3,4]。另一方面, 擬菱形藻產(chǎn)生多莫酸的特征又是不穩(wěn)定的, 如中國海域的福氏擬菱形藻P. fukuyoiLim, Teng, Leaw & Lim能夠產(chǎn)毒[5], 但是其馬來西亞株系卻是無毒的[6]。

以往研究已經(jīng)證實(shí)擬菱形藻在我國沿海廣泛分布[7,8], 但相關(guān)研究還相對有限。截止目前, 我國報道的擬菱形藻物種有24個[4,5,8—10], 但對于部分物種的認(rèn)知還僅停留在形態(tài)學(xué)水平, 現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的引入還十分有限, 造成物種信息不全、鑒定結(jié)論不可靠, 因此目前對于我國海域擬菱形藻屬物種多樣性還難以有清晰的認(rèn)識。另外, 關(guān)于我國海域的產(chǎn)毒擬菱形藻, 近兩年才陸續(xù)報道了2個物種:偽裝擬菱形藻P. simulansLi, Huang & Xu[4]和福氏擬菱形藻P. fukuyoi[5]。但相對于我國遼闊的近海海域而言, 僅有2種產(chǎn)毒擬菱形藻顯然是不切實(shí)際的。近年我國多處海域的海產(chǎn)品中已檢出DA[11—13],表明中國海域DA的分布是廣泛的, 其DA生物來源也應(yīng)該是多樣的。為了明確我國海域產(chǎn)毒擬菱形藻的物種多樣性, 本文基于建立的單克隆培養(yǎng)株系,開展了種源信息和產(chǎn)毒特征的工作。

1 材料與方法

1.1 單克隆藻株的建立

用浮游植物網(wǎng)(孔徑10 μm)進(jìn)行水平拖網(wǎng), 采集活體水樣, 盡快帶回實(shí)驗(yàn)室。利用毛細(xì)管復(fù)洗法在倒置顯微鏡(Mshot MI-12)下分離目標(biāo)藻細(xì)胞, 經(jīng)過多洗水洗和轉(zhuǎn)移, 以確保單克隆藻株的純化。最后轉(zhuǎn)移至預(yù)先滴有培養(yǎng)基的48孔細(xì)胞培養(yǎng)板中, 以普通熒光燈為光源, 光周期12h∶12h, 溫度(20±2)℃的條件下培養(yǎng)。待其存活并繁殖達(dá)到約100個藻細(xì)胞之后, 轉(zhuǎn)移到盛有培養(yǎng)基的100 mL錐形瓶中培養(yǎng),以MC (Marine Collection)序列進(jìn)行編號(表1)。

1.2 鹵蟲的培養(yǎng)及誘導(dǎo)

購買商品化鹵蟲卵, 用滅菌人工海水沖洗干凈至無氣味, 投入經(jīng)過滅菌處理的L培養(yǎng)基中, 孵化溫度等條件與擬菱形藻培養(yǎng)條件一致。約2d后, 將10—20個成體鹵蟲轉(zhuǎn)移到擬菱形藻培養(yǎng)液中(細(xì)胞密度為106cell/L)。放置在光周期12h∶12h, 溫度在(20±2)℃的條件下混合培養(yǎng)約7—8d[5]。

1.3 LC-MS/MS法檢測藻毒素

取處于生長穩(wěn)定期中后期的藻液400 mL左右,經(jīng)0.22 μm醋酸纖維濾膜過濾收集藻細(xì)胞。用5 mL甲醇水(1∶1)將濾膜上的藻細(xì)胞洗脫到離心管中。將藻液用超聲波破碎儀冰浴破碎3—5min, 經(jīng)0.22 μm濾膜過濾, 濾液于–20℃下保存?zhèn)溆?。樣品送至農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測與評價重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室檢測DA含量。

采用Prominence UFLC超快速液相色譜(Shimadzu公司)和5500 QTRAP四極桿-線性離子阱復(fù)合質(zhì)譜檢測系統(tǒng)(SCIEX公司)對預(yù)處理的樣品進(jìn)行DA檢測, 參見Wu等[14]方法進(jìn)行分析。DA標(biāo)準(zhǔn)品購自德國Sigma公司。

表1 本文建立的擬菱形藻單克隆培養(yǎng)株系Tab. 1 List of monoclonal Pseudo-nitzschia strains investigated in this study

1.4 形態(tài)學(xué)觀察

光學(xué)顯微鏡(Light Microscopy, LM)觀察: 取處于對數(shù)生長期的藻液0.1 mL, 滴在載玻片上, 蓋上玻片后, 利用Olympus BX53進(jìn)行微分干涉(Differential Interference Contrast, DIC)的觀察, 并使用Olympus DP27數(shù)碼相機(jī)拍照, 在Olympus Cell-Sens軟件上獲取圖像信息。主要觀察群體特征、細(xì)胞色素體形態(tài)等。

透射電子顯微鏡(Transmission Electron Microscopy, TEM)觀察: 取對數(shù)生長期的藻液2 mL, 加入等量濃硫酸(＞95%)以去除有機(jī)質(zhì), 然后用蒸餾水多次水洗至中性[15]。用微量進(jìn)樣器吸取5—10 μL酸化后的水樣, 滴加在噴鍍碳膜的銅網(wǎng)(100目)上, 自然晾干后, 即可在JEM-1010 TEM下觀察和拍照。主要觀察殼面超微結(jié)構(gòu), 如點(diǎn)條紋、肋突、孔紋等。

1.5 分子系統(tǒng)學(xué)分析

離心法收集處于對數(shù)生長期的藻細(xì)胞, 進(jìn)行總DNA的提取[16]。利用引物ITS1和ITS4進(jìn)行核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)的擴(kuò)增和測序[6]。PCR產(chǎn)物送至上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司進(jìn)行純化和測序。從NCBI下載擬菱形藻物種的ITS nrDNA序列, 使用BioEdit軟件進(jìn)行序列的比對和矩陣[17]。利用Mr-Modeltest 2.3計算選擇貝葉斯推理樹最適模型[18]。用MrBayes 3.2[19]構(gòu)建貝葉斯推理樹(Bayesian Inference, BI), 用RAxML-HPC2[20]構(gòu)建最大似然樹(Maximum Likelihood, ML), 其中ML分析的自檢值(bootstrap test)設(shè)定為1000。

2 結(jié)果

2.1 多莫酸的LC-MS/MS檢測

以DA標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ng/mL)為橫坐標(biāo), 峰面積為縱坐標(biāo), 建立DA的LC-MS/MS檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線,DA濃度為10—1000 ng/mL時, 其峰面積與質(zhì)量濃度有良好的線性關(guān)系(R2=0.99934), 回歸方程為:y=164.64875x–3947.22457。本方法的檢測下限為10 ng/mL。DA的出峰保留時間為0.77min。分別對純種培養(yǎng)株系和鹵蟲混培誘導(dǎo)株系進(jìn)行檢測, 詳細(xì)檢出結(jié)果見表2。

本文建立的15個純種培養(yǎng)藻株中, 6個株系未檢出DA, 其余9個株系檢出DA, 單細(xì)胞產(chǎn)毒量0.4—17.5 fg。

挑選了3個株系進(jìn)行鹵蟲混培下的DA誘導(dǎo),MC4049與MC3015的產(chǎn)毒水平略有下降, 單細(xì)胞產(chǎn)毒水平分別由2和1 fg降至0.2和0.4 fg, 而MC4074的產(chǎn)毒特征則有明顯變化, 單細(xì)胞產(chǎn)毒水平為17.5 fg,而其純種株系并未有DA檢出。

表2 本文的DA檢出結(jié)果Tab. 2 The results of DA’s content detected in this study

2.2 產(chǎn)毒擬菱形藻的物種鑒定

基于形態(tài)學(xué)和分子系統(tǒng)學(xué)的數(shù)據(jù), 對10個產(chǎn)毒株系進(jìn)行了物種鑒定, 確認(rèn)它們分別隸屬于3個物種: 尖細(xì)擬菱形藻P. cuspidata(Hasle) Hasle、偽柔弱擬菱形藻P. pseudodelicatissima(Hasle) Hasle、偽善擬菱形藻P. fraudulenta(Cleve) Hasle, 其中偽善擬菱形藻是我國的新記錄種。

尖細(xì)擬菱形藻Pseudo-nitzschia cuspidata(Hasle) Hasle(圖版 Ⅰ) 細(xì)胞可形成階梯狀群體, 重疊部分占?xì)っ嫒L的1/6—1/8左右(圖版 Ⅰ-1)。殼面披針形(圖版 Ⅰ-2)。長41—43 μm, 寬1.6—1.9 μm。殼端尖(圖版 Ⅰ-3), 管殼縫強(qiáng)烈偏心,具有中央較大船骨點(diǎn)(圖版Ⅰ-4)。肋突分布均勻,10 μm內(nèi)20—22條。點(diǎn)條紋由一排橢圓形的孔紋組成(圖版 Ⅰ-5), 密度為40—43條/10 μm?？准y密度為7個/μm?？准y多分成兩半(圖版 Ⅰ-5), 也有分成2—5個部分的(圖版 Ⅰ-4)。本文只觀察到二條環(huán)帶(圖版 Ⅰ-6), 殼環(huán)帶高一個孔紋, 點(diǎn)條紋密度為56—57條/10 μm。

產(chǎn)毒特征: 本種在美國西海岸和澳大利亞均有產(chǎn)毒報道, 單細(xì)胞產(chǎn)毒量分別為6.3×104fg[21]和4.3×103—2.5×104fg[22]。本文株系亦有DA檢出, 單細(xì)胞產(chǎn)毒水平為0.5—5.5 fg。

生態(tài): 海水浮游生活。

分布: 全球廣布種, 澳大利亞、墨西哥灣、西班牙、美國西海岸均有分布[21—25]。本文標(biāo)本采自廣東大亞灣(8月、10月)和海南文昌(11月), 共建立11個培養(yǎng)株系(表2)。

偽柔弱擬菱形藻Pseudo-nitzschia pseudodelicatissima (Hasle) Hasle(圖版 Ⅱ) 細(xì)胞可形成階梯狀群體, 重疊部分占?xì)っ嫒L的1/5—1/6(圖版Ⅱ-1)。殼面披針形(圖版 Ⅱ-2), 殼端尖(圖版 Ⅱ-3)。殼面長52—61 μm, 寬1.4—1.6 μm。管殼縫強(qiáng)烈偏心, 具有中央較大船骨點(diǎn)(圖版 Ⅱ-4)。肋突密度為19—24條/10 μm。點(diǎn)條紋由一排孔紋組成, 密度為39—43條/10 μm?？准y圓形或橢圓形, 多分成兩部分(圖版 Ⅱ-5), 6—7個/μm。殼環(huán)帶高一排孔紋(圖版 Ⅱ-6)。第二條環(huán)帶孔紋橢圓形(圖版 Ⅱ-7),環(huán)帶上孔紋密度為48—53條/10 μm。

毒性: 本種在地中海曾有產(chǎn)毒報道, 單細(xì)胞產(chǎn)毒量為4.5—9.3 fg[26], 本文株系亦有DA檢出, 單細(xì)胞產(chǎn)毒水平為1 fg。

生態(tài): 海水浮游生活。

分布: 全球廣布種, 澳大利亞、丹麥、墨西哥、新西蘭、美國西海岸等有分布[23,26,27]。本文標(biāo)本采自臺灣海峽(4月), 共建立2個培養(yǎng)株系(表2)。

偽善擬菱形藻Pseudo-nitzschia fraudulenta(Cleve) Hasle(圖版 Ⅲ) 細(xì)胞可形成階梯狀群體, 重疊部分占?xì)っ嫒L的1/7(圖版 Ⅲ-1)。殼面線形, 兩側(cè)對稱, 在殼面中部幾乎平行(圖版 Ⅲ-2)。殼端略尖(圖版 Ⅲ-3)。管殼縫強(qiáng)烈偏心, 具有中央較大船骨點(diǎn)(圖版 Ⅲ-4)。殼面長60—66 μm, 寬3.9—4.5 μm。肋突分布不均勻, 密度為13—17條/10 μm。點(diǎn)條紋由兩排緊密排列的孔紋組成, 密度為25—30條/10 μm。孔紋圓形, 內(nèi)部被分成3—5個部分(圖版 Ⅲ-6)。殼環(huán)帶高6—7個孔紋, 寬2個孔紋(圖版 Ⅲ-5), 環(huán)帶上點(diǎn)條紋38—45條/10 μm。

毒性: 本種在美國加利福尼亞曾有產(chǎn)毒報道[28]。本文的純種株系中未有DA檢出, 但在鹵蟲混培下可檢出DA, 單細(xì)胞產(chǎn)毒水平為17.5 fg。

生態(tài): 海水浮游生活。

分布: 本種在美國西海岸[28]、澳大利亞東南部海域有分布[22]。本文標(biāo)本采自廣東大亞灣(11月),共建立2個培養(yǎng)株系(表2)。

基于ITS序列的分子系統(tǒng)學(xué)分析基于ITS1-5.8S-ITS2序列建立了分子系統(tǒng)樹, ML樹和BPP樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)一致(圖1)。本文的尖細(xì)擬菱形藻株系與以往報道的尖細(xì)擬菱形藻墨西哥株系(Mex12)聚在同一分支上, 尖細(xì)擬菱形藻8個產(chǎn)毒株系中, 株系MC3252、MC3329和MC3337的ITS基因完全相同, 株系MC3253、MC3317、MC3331和MC4049的ITS基因完全相同, 前者與后者有10個堿基差異。前者株系與Mex12株系有13個堿基差異,后者與Mex12株系有6個堿基差異。兩個偽柔弱擬菱形藻株系與偽柔弱擬菱形藻希臘株系(8A10, AL-15)聚在一起, MC3005和MC3015的基因完全一樣,與系統(tǒng)發(fā)育樹上8A10株系有2個堿基差異, 與AL-15株系有2個堿基差異。2個偽善擬菱形藻株系與偽善擬菱形藻西班牙株系(Limens1)、澳大利亞株系(KC017467)聚在同一分支上, MC4058與MC4074堿基完全一樣, 與偽善擬菱形藻西班牙株系(Limens1)有9堿基差異, 與澳大利亞株系(KC017467)有20個堿基差異。ITS序列相對高變,同一物種的不同地理株系之間亦會存在差異。系統(tǒng)樹顯示上述株系間堿基差異并未影響物種的聚類, 屬于種內(nèi)差異, 因此分子鑒定支持形態(tài)鑒定的結(jié)果。

圖1 基于核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS1-5.8S-ITS2的分子系統(tǒng)樹Fig. 1 Molecular phylogenetic tree inferred from ITS1-5.8S-ITS2 region sequences

3 討論

3.1 中國海域產(chǎn)毒擬菱形藻的物種多樣性

本文報道的3種產(chǎn)毒擬菱形藻, 曾在國外海域有產(chǎn)毒報道。如采自澳大利亞[22]的5株尖細(xì)擬菱形藻, 其中2株檢出DA, 單細(xì)胞產(chǎn)毒量分別為2.5×104和4.3×103fg。Trainer等[21]在2009年報道了尖細(xì)擬菱形藻藻華, 自然海水中DA含量高達(dá)43 nmol/L, 單細(xì)胞產(chǎn)毒量為6.3×104fg。地中海東北部海域[26]的6株偽柔弱擬菱形藻中, 有3株檢出DA, 單細(xì)胞產(chǎn)毒量為4.5—9.3 fg。Gárate-Lizárraga等[28]報道了美國加利福尼亞州海灣發(fā)生的偽善擬菱形藻藻華, 自然海水中DA含量為52 ng/filter。

在過去的20余年, 我國學(xué)者持續(xù)關(guān)注中國海域擬菱形藻的產(chǎn)毒特征, 但一直未能發(fā)現(xiàn)產(chǎn)毒株系。最早的工作開始于2005年, Li等[29]對分離自長江口的一株尖刺擬菱形藻P. pungensHasle進(jìn)行了檢測,未有DA的檢出。之后, 邢小麗等[30]、楊軍霞[31]、黃迎艷[32]、徐國雙和李揚(yáng)[9]、黃春秀等[10]陸續(xù)檢測了100多個擬菱形藻株系, 均未有DA的檢出。直至近年, 才陸續(xù)有中國海域產(chǎn)毒擬菱形藻的報道。Li等[4]在廣東沿海發(fā)現(xiàn)了1個新種: 偽裝擬菱形藻(P. simulans), 并在培養(yǎng)株系中檢測到DA, 單細(xì)胞產(chǎn)毒水平是1.05—1.54 fg, 這是我國產(chǎn)毒擬菱形藻的首次報道。隨后, 黃春秀等[5]報道了1個新記錄種-福氏擬菱形藻(P. fukuyoi), 在5株培養(yǎng)株系中均能檢測到DA, 單細(xì)胞產(chǎn)毒水平為20—1630 fg。截止目前, 我國已有2種產(chǎn)毒擬菱形藻的報道。然而,相關(guān)研究仍相對有限, 檢測藻株較少, 尚不能全面反映中國海域擬菱形藻的產(chǎn)毒情況。本文報道了3個產(chǎn)毒種, 豐富了我國產(chǎn)毒擬菱形藻的物種多樣性, 將其物種數(shù)提高為5個。但海產(chǎn)品中DA的檢出,顯示DA在我國沿海分布廣泛[11—13], 產(chǎn)毒擬菱形藻的物種多樣性也應(yīng)該是多樣化的, 應(yīng)該還有更多的產(chǎn)毒種未被認(rèn)知。

3.2 產(chǎn)毒特征與浮游動物的關(guān)系

擬菱形藻的產(chǎn)毒特征是不穩(wěn)定的, 受到多種環(huán)境因素的影響, 如光照、溫度、不同生活史階段、磷、硅、微量元素等[1,2]。近年有研究發(fā)現(xiàn)浮游動物攝食會提高某些擬菱形藻物種的產(chǎn)毒水平[33], 甚至能夠誘導(dǎo)未曾報道過產(chǎn)毒的擬菱形藻物種開始產(chǎn)生DA[34]。如Hareardóttir等[34]將不產(chǎn)毒的鈍頭擬菱形藻P. obtusa與橈足類Calanus copepodites混和培養(yǎng), 發(fā)現(xiàn)鈍頭擬菱形藻開始分泌DA, 橈足類體內(nèi)富集DA濃度可達(dá)到0.4×10?4ng DA/μg C。本文的偽善擬菱形藻(MC4074)在純種培養(yǎng)條件下并未檢出DA, 但在鹵蟲混培條件下可檢出DA, 也驗(yàn)證了這一觀點(diǎn)。關(guān)于浮游動物誘導(dǎo)擬菱形藻產(chǎn)生DA的機(jī)制和生態(tài)學(xué)意義, 有學(xué)者認(rèn)為橈足類的刺激作用并不是通過與藻細(xì)胞直接接觸而實(shí)現(xiàn)的, 應(yīng)該是通過釋放的某種小分子化學(xué)物質(zhì)來完成, 但化學(xué)物質(zhì)的具體成分尚不明確[33]。另外, 擬菱形藻產(chǎn)生更多DA可以抑制橈足類的攝食, 甚至影響橈足類的產(chǎn)卵率和孵化率, 從而減少藻類被攝食的概率, 具有顯著的生態(tài)學(xué)意義[33]。

本文利用鹵蟲誘導(dǎo)擬菱形藻產(chǎn)毒, 希望能夠提高產(chǎn)毒量, 但是也出現(xiàn)了產(chǎn)毒量下調(diào)的現(xiàn)象, 如在鹵蟲混培條件下, 尖細(xì)擬菱形藻(MC4049)和偽柔弱擬菱形藻(MC3015)的產(chǎn)毒水平都有所下降, 單細(xì)胞產(chǎn)毒量分別前者從2 fg降低至0.2 fg, 后者從1 fg降至0.4 fg。分析其原因, 或許與擬菱形藻株系的人工保種時間過長有關(guān), 因?yàn)殡S著培養(yǎng)時間的延長,擬菱形藻的產(chǎn)毒能力會快速降低。本文2個株系(MC4049和MC3015)純種條件下的產(chǎn)毒檢測, 是在株系建立后的一個月內(nèi)完成的, 而浮游動物誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)則是在保種半年之后進(jìn)行的。

3.3 與相似種的比較研究

尖細(xì)擬菱形藻在形態(tài)上與偽柔弱擬菱形藻較難區(qū)分。Lundholm等[23]認(rèn)為二者細(xì)微差異在于外形和殼面觀: 偽柔弱擬菱形藻呈線形, 尖細(xì)擬菱形藻呈披針形, 而本文報道的偽柔弱擬菱形藻則是披針形。李揚(yáng)等[35]報道的偽柔弱擬菱形藻的環(huán)面觀是線形或披針形, 殼面外形并不能作為尖細(xì)擬菱形藻與偽柔弱擬菱形藻的重要區(qū)別。另外, 本文中尖細(xì)擬菱形藻的肋突密度(20—22條/10 μm)、點(diǎn)條紋密度(40—43條/10 μm)與偽柔弱擬菱形藻(肋突密度為19—24條/10 μm, 點(diǎn)條紋密度為39—43條/10 μm)的相接近, 但偽柔弱擬菱形藻(長52—61 μm,寬1.36—1.6 μm)比尖細(xì)擬菱形藻(長41—43 μm, 寬1.58—1.9 μm)較細(xì)長。在分子系統(tǒng)樹上, 尖細(xì)擬菱形藻與偽柔弱擬菱形藻的分子親緣關(guān)系也是最為接近的, 但兩者的二級結(jié)構(gòu)有4個HCBCs的差異。

偽善擬菱形藻與亞偽善擬菱形藻P. subfraudulenta(Hasle) Hasle的形態(tài)相似, 分子親緣關(guān)系最為接近。Hasle等[36]認(rèn)為兩者之間的最大區(qū)別是殼面外形, 偽善擬菱形藻是披針形, 亞偽善擬菱形藻則是線形。但是此后的研究發(fā)現(xiàn)這兩個物種的殼面外形可能是多變的, 兼具披針形和線形, 如美國加利福尼亞州海灣[28]和澳大利亞海域[22]的偽善擬菱形藻殼面是線形的, 墨西哥海域[37]的亞偽善擬菱形藻是披針形。本文亦支持這一觀點(diǎn)。此外, Moschandreou等[26]認(rèn)為殼環(huán)帶特征或許可以兩者之間的區(qū)別依據(jù)。偽善擬菱形藻的殼環(huán)帶高有6—7個孔紋,寬2個孔紋[22], 而亞偽善擬菱形藻的殼環(huán)帶高2個孔紋, 寬2個孔紋[37]。

本文報道的尖細(xì)擬菱形藻和偽柔弱擬菱形藻,此前在我國海域都曾有分布記錄[7,8], 但以往研究的物種鑒定手段較為單一, 僅僅依據(jù)形態(tài)學(xué)特征。近年研究認(rèn)為, 擬菱形藻物種之間的形態(tài)區(qū)別細(xì)微,某些特征也易發(fā)生變化, 因此形態(tài)特征不能作為物種鑒別的主要依據(jù), 分子生物學(xué)數(shù)據(jù)的引入是有效手段之一[16]。

圖版Ⅰ 尖細(xì)擬菱形藻PlateⅠ Pseudo-nitzschia cuspidata

圖版Ⅱ 偽柔弱擬菱形藻PlateⅡ Pseudo-nitzschia pseudodelicatissima

圖版Ⅲ 偽善擬菱形藻PlateⅢ Pseudo-nitzschia fraudulenta