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        褪黑素對(duì)非生物脅迫下雨生紅球藻中蝦青素積累的影響

        2018-09-13 07:38:22岳陳陳徐軍偉余旭亞
        水生生物學(xué)報(bào) 2018年5期
        關(guān)鍵詞:雨生紅雨生球藻

        岳陳陳 丁 巍 李 濤 趙 鵬 徐軍偉 余旭亞

        (昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 昆明 650500)

        雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)是一種單細(xì)胞綠藻[1], 在生物或非生物脅迫下能夠積累蝦青素, 含量最高可達(dá)細(xì)胞干重的4%[2], 高于其他已知的蝦青素來(lái)源。蝦青素(3, 3′-二羥基-β, β-胡蘿卜素-4, 4′-二酮)是一種紅色酮類胡蘿卜素, 有13個(gè)單雙鍵交替排列的共軛鍵, 因此具有強(qiáng)抗氧化性、中和自由基、清除活性氧的特性[3,4], 廣泛應(yīng)用在食品、飼料、化妝品以及醫(yī)藥行業(yè), 具有較高的商業(yè)價(jià)值[5,6]。然而, 蝦青素生產(chǎn)中卻存在著生產(chǎn)成本高、產(chǎn)量低等問(wèn)題, 因此, 采用有效策略提高雨生紅球藻蝦青素產(chǎn)量成為研究的熱點(diǎn)。

        褪黑素(Melatonin, MLT)是一種廣泛存在于生物界的激素, 在動(dòng)物、植物以及微生物中均已發(fā)現(xiàn),先前研究表明MLT具有降低細(xì)胞內(nèi)活性氧、清除自由基、調(diào)節(jié)生物周期節(jié)律、信號(hào)分子和光合作用等功能[7—9], 從而對(duì)生物體代謝途徑進(jìn)行調(diào)控。研究顯示雨生紅球藻在脅迫條件如高光照、缺氮等[10,11]條件下, 有利于蝦青素的積累。另外, 脅迫條件下細(xì)胞內(nèi)發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生活性氧(Reactive oxygen species, ROS), 作為信號(hào)分子參與生物系統(tǒng)的信號(hào)通路[12—14]; 一氧化氮 (Nitric oxide, NO)和水楊酸(Salicylic acid, SA)是植物中的信號(hào)分子, 參與固有的防御體系, 應(yīng)對(duì)不利的生長(zhǎng)條件[15,16]。雨生紅球藻蝦青素的生物合成開(kāi)始于2-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸(MEP)途徑, 以丙酮酸和甘油醛-3-磷酸(GA3P)為起始物, 經(jīng)第一個(gè)限速酶, 1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)催化, 形成1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸(DOXP), 用于后續(xù)的蝦青素合成,dxs基因表達(dá)量的增加可提高DOXP的生成量, 進(jìn)而促進(jìn)蝦青素的合成[17]。研究發(fā)現(xiàn)MLT能大幅提高單針藻中油脂含量, 而油脂和蝦青素都是微藻的次級(jí)代謝產(chǎn)物且合成又聯(lián)系密切[18,19], 這為本研究將MLT用于雨生紅球藻誘導(dǎo)產(chǎn)蝦青素提供了理論依據(jù)。

        本研究選用MLT對(duì)雨生紅球藻進(jìn)行誘導(dǎo), 檢測(cè)MLT對(duì)生長(zhǎng)、蝦青素積累、信號(hào)分子以及蝦青素合成途徑中關(guān)鍵酶基因表達(dá)量的影響, 進(jìn)而對(duì)MLT誘導(dǎo)蝦青素合成的機(jī)制進(jìn)行分析探討。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        雨生紅球藻由本實(shí)驗(yàn)室篩選、保存。MLT: 上海生工生物工程股份有限公司; 活性氧檢測(cè)試劑盒、總一氧化氮檢測(cè)試、Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒: 上海碧云天生物技術(shù)有限公司;SA檢測(cè)試劑盒: 美國(guó)Bio Vision公司; 甲醇、DMSO(均為分析純): 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司;丙酮: 重慶川東化工(集團(tuán))有限公司; KOH: 重慶北碚化學(xué)試劑廠; 二氯甲烷: 天津市興復(fù)科技發(fā)展有限公司。

        1.2 儀器與設(shè)備

        XS-212-202顯微鏡: 江南光電(集團(tuán))股份有限公司; 1730R高速冷凍離心機(jī): 丹麥Labogene Scanspeed公司; FA2004N分析天平: 上海箐海儀器有限公司; DS-8510DTH超聲波微波組合體系: 上海生析超聲儀器有限公司; Ultrospec 2100pro紫外可見(jiàn)分光光度計(jì): 安瑪西亞(中國(guó))有限公司; HHW-D6水浴鍋: 金壇雙捷實(shí)驗(yàn)儀器廠; VS-840-1超凈工作臺(tái): 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司; LDZX-50KBS滅菌鍋:上海申安醫(yī)療器械廠; 5804R離心機(jī): 德國(guó)Eppendorf公司; FD5-12冷凍干燥機(jī): 西盟國(guó)際集團(tuán); 熒光定量PCR儀: 美國(guó)伯樂(lè)公司; 高效液相儀: waters 996。

        1.3 方法

        雨生紅球藻的培養(yǎng)選用Bold’s Basal Medium(BBM)[20]為基礎(chǔ)培養(yǎng)基, 將純化過(guò)的雨生紅球藻轉(zhuǎn)接到3 L(內(nèi)置2 L培養(yǎng)基)錐形瓶中, 控制培養(yǎng)溫度(25±1)℃, 光照強(qiáng)度50 μE/(m2·s), 持續(xù)通入0.1 vvm的無(wú)菌空氣, 培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(此時(shí)生物量約為7×105cells/mL)。

        將MLT誘導(dǎo)MLT溶于乙醇中配制成濃度為0.21 mol/L的MLT母液, 備用。將細(xì)胞液培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期5000×g離心3min收集細(xì)胞, 用無(wú)菌水洗滌3次, 除去殘留培養(yǎng)基, 重懸浮于缺氮的BBM培養(yǎng)基中, 配成體系為350 mL生物量為2.5×105cells/mL的光生物反應(yīng)器, 使誘導(dǎo)培養(yǎng)基的MLT濃度為0、5、10和15 μmol/L(保持加入相同的乙醇), 每個(gè)梯度設(shè)置3個(gè)平行樣??刂婆囵B(yǎng)溫度(27±1) ℃, 216 μE/(m2·s)持續(xù)光照, 連續(xù)通入0.04 vvm的無(wú)菌空氣培養(yǎng)15d, 進(jìn)行隔天取樣, 測(cè)定藻細(xì)胞生物量以及蝦青素積累量, 同時(shí)取樣用于后續(xù)的NO、SA和ROS的測(cè)定。

        測(cè)定細(xì)胞生物量和蝦青素含量采用高效液相法測(cè)定雨生紅球藻蝦青素的含量。隔天定期取50 mL誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的藻液, 5000 r/min離心3min, 棄上清收集藻細(xì)胞, 使用超純水洗三次, 加入5 mL甲醇-二氯甲烷(3∶1)提取液, 冰水浴下用勻漿機(jī)2800 r/min勻漿20s, 勻漿液10000×g低溫離心15min, 轉(zhuǎn)移上清至另一試管中。重復(fù)提取2—3次,至沉淀物基本呈現(xiàn)無(wú)色為止。將收集的所有提取液10000×g再次低溫離心15min, 取上清用高效液相色譜儀測(cè)定, 色譜柱為C18柱(waters, 25 cm×4.6 mm,5 mm)流動(dòng)相A(丙酮)和流動(dòng)相B(甲醇∶水=9∶1,v/v)遵循: 25min B 80%—20%, 10min 20% B, 5min B 20%—80%, 流速為1.25 mL/min; 檢測(cè)器為waters 996光電二極管陣列檢測(cè)器, 進(jìn)樣量30 μL測(cè)定波長(zhǎng)476 nm, 積分得到蝦青素質(zhì)量濃度 (mg/L)。

        此外, 每隔一天定期取10 mL誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的藻液, 離心收集細(xì)胞, 冷凍, 干燥, 稱重, 細(xì)胞生物量和蝦青素含量按以下公式計(jì)算:

        同時(shí), 分別計(jì)算出游離蝦青素和蝦青素酯的含量。

        細(xì)胞內(nèi)ROS、NO和SA含量測(cè)定和抑制劑處理將收集的樣品按照Che等[21]的方法使用活性氧檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)活性氧的含量。測(cè)定內(nèi)源的SA和NO水平,離心收集所取樣品并水洗2次, 磨碎藻細(xì)胞, 使用水楊酸檢測(cè)試劑盒(Bio Vision, America)和總NO檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)SA和NO的水平。

        為了測(cè)定在脅迫條件下MLT與NO、ROS以及SA之間的關(guān)系, 將微藻分別培養(yǎng)在含有10 μmol/L MLT+200 μmol/L carboxy-PTIO (NO清除劑)、10 μmol/L MLT+100 μmol/L paclobutrazol (PAC,SA抑制劑)和10 μmol/L MLT+10 mmol/L N-acetyl-L-cysteine (NAC, ROS清除劑)的缺氮BBM培養(yǎng)基中, 隔天取樣, 測(cè)定蝦青素含量。

        雨生紅球藻dxs基因表達(dá)分析本試驗(yàn)使用Primer5.0設(shè)計(jì)、上海生工合成dxs酶基因上下游擴(kuò)增引物: 5′-ACAACCAGCAGGTGTCGC-3′與5′-CCGTCTCCGCACTCTTCA-3′, 擴(kuò)增出序列后測(cè)序,以此為模板設(shè)計(jì)熒光引物dxsF (5′-GTCTCCGCAC TCTTCACC-3′)與dxsR (5′-CCCACCCAGTACA ACAAC-3′), 用Trizol法提取不同濃度MLT處理的微藻RNA, 采用RT-PCR法檢測(cè)dxs酶基因的表達(dá)量,以18S (引物: 5′-CGGTCTGCCTCTGGTATG-3′與5′-GCTTGCTTTGAACACGCT-3′)基因作為內(nèi)標(biāo)來(lái)調(diào)節(jié)RNA的用量和循環(huán)數(shù), 使內(nèi)標(biāo)基因在不同濃度誘導(dǎo)下的表達(dá)豐度一致。

        1.4 數(shù)據(jù)處理

        本實(shí)驗(yàn)重復(fù)了5次, 每次均設(shè)置3個(gè)平行樣, 所有圖表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差, 使用ANOVA(SPSS 19.0)一步法分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。最小顯著性差異進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)調(diào)查不同試驗(yàn)的組間差異, 圖中“*”表示同一時(shí)間與其他組差異顯著(P<0.05);“**”表示同一時(shí)間與其他組差異極顯著(P<0.01)。

        2 結(jié)果

        2.1 MLT對(duì)微藻細(xì)胞生物量的影響

        雨生紅球藻在誘導(dǎo)條件下生物量會(huì)發(fā)生變化,為了探究外源添加MLT對(duì)雨生紅球藻生長(zhǎng)的影響,測(cè)定了不同濃度不同時(shí)間微藻的生長(zhǎng)情況, 如圖1所示, 所有組在誘導(dǎo)條件下的生長(zhǎng)情況不同, 培養(yǎng)15d后, 對(duì)照組生物量達(dá)到了0.77 g/L, 15、10和5 μmol/L MLT處理濃度的細(xì)胞量峰值分別達(dá)到0.62、0.69和0.64 g/L, 低于對(duì)照組, 根據(jù)生物量的變化趨勢(shì)可知, 15 μmol/L MLT誘導(dǎo)組有明顯的下降趨勢(shì)。這一現(xiàn)象表明低濃度的MLT處理對(duì)H.pluvialis生長(zhǎng)沒(méi)有促進(jìn)作用, 而高濃度的MLT處理抑制微藻細(xì)胞的生長(zhǎng)。

        圖1 不同濃度的MLT對(duì)微藻生長(zhǎng)的影響Fig. 1 Effects of MLT on the biomass of H. pluvialis during induction process

        2.2 MLT對(duì)雨生紅球藻蝦青素積累的影響

        由圖2可知, 在誘導(dǎo)條件下不同濃度的MLT對(duì)細(xì)胞內(nèi)蝦青素積累影響存在差異, 蝦青素積累量與MLT間存在明顯的劑量效應(yīng), MLT處理組中,MLT濃度為10 μmol/L時(shí)蝦青素含量顯著增加, 而在其他濃度處理組蝦青素含量沒(méi)有明顯變化。10 μmol/L MLT處理組在開(kāi)始誘導(dǎo)9d后蝦青素積累開(kāi)始顯著增加, 13d時(shí)蝦青素積累量達(dá)到最大(31.32 mg/g), 是對(duì)照組(13.27 mg/g)的2.36倍。在MLT濃度為5和15 μmol/L時(shí), 蝦青素的最大積累量分別為15.41和7.86 mg/g, 可能是高濃度的褪黑素抑制蝦青素的積累。10 μmol/L的MLT處理雖然對(duì)微藻生物量沒(méi)有積極影響, 但是明顯提高了蝦青素的積累量。

        圖2 不同濃度MLT對(duì)雨生紅球藻蝦青素含量的影響Fig. 2 Effects of MLT on astaxanthin content of H. pluvialis during induction process

        2.3 MLT對(duì)微藻細(xì)胞ROS的影響

        活性氧檢測(cè)試劑盒中的探針DCFH-DA可以自由穿過(guò)細(xì)胞膜,進(jìn)入細(xì)胞后被胞內(nèi)的酯酶水解成DCFH,ROS氧化無(wú)熒光的DCFH生成有熒光的DCF,檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度得到細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平。圖3 顯示,細(xì)胞暴露在高光照、缺氮脅迫條件時(shí),胞內(nèi)的活性氧水平快速提高,第7天時(shí),胞內(nèi)活性氧水平達(dá)到最高,隨后呈現(xiàn)出下降趨勢(shì),在培養(yǎng)過(guò)程中,10 μmol/L MLT處理組和對(duì)照組呈現(xiàn)出相似的趨勢(shì),但始終低于對(duì)照組,Shi等[7]在狗牙根(bermudagrass)中也有相似的結(jié)果。ROS抑制劑組活性氧一直處于很低的水平,同時(shí)對(duì)蝦青素含量進(jìn)行測(cè)定,發(fā)現(xiàn)蝦青素含量很低(圖3)。結(jié)果表明,活性氧對(duì)雨生紅球藻蝦青素的合成至關(guān)重要,適量的ROS觸發(fā)蝦青素積累,過(guò)高時(shí)對(duì)微藻細(xì)胞產(chǎn)生毒害,過(guò)低時(shí)又不能有效的觸發(fā)蝦青素積累。

        2.4 MLT誘導(dǎo)對(duì)細(xì)胞NO的影響

        NO是一種不穩(wěn)定的氣態(tài)分子,在細(xì)胞內(nèi)很快代謝成硝酸鹽和亞硝酸鹽,通過(guò)檢測(cè)兩者的總量來(lái)計(jì)算NO的量。結(jié)果顯示外源MLT能顯著提高細(xì)胞內(nèi)NO含量(圖4),NO水平起初逐步下降,在第7天時(shí), 10 μmol/L MLT處理組達(dá)到最高(73 μmol/L),是對(duì)照組的4.06倍,此時(shí),MLT處理組蝦青素的含量也開(kāi)始明顯高于對(duì)照組(圖4),抑制劑處理顯著抑制了NO濃度,蝦青素的最大積累量也顯著下降,達(dá)到9.36 mg/g,分別是對(duì)照組和10 μmol/L MLT處理的64.84 %和23.94 %。結(jié)果表明,NO在蝦青素生物合成中起到一定的調(diào)控作用,有助于蝦青素的積累。

        2.5 MLT誘導(dǎo)對(duì)藻細(xì)胞內(nèi)SA含量的影響

        SA是一種信號(hào)分子, 參與植物對(duì)脅迫條件的應(yīng)激反應(yīng), 能調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育。10 μmol/L MLT處理的SA水平第1、第3天時(shí)顯著高于對(duì)照組,第7天時(shí)達(dá)到最高隨后下降, 對(duì)照組在第9天時(shí)達(dá)到最高, SA抑制組波動(dòng)不大且含量較低(圖5)。由圖5 可知, SA抑制劑組蝦青素的含量很低。結(jié)果表明, MLT處理組能有效調(diào)節(jié)SA含量, 且促進(jìn)了蝦青素的增長(zhǎng), SA被抑制時(shí), 蝦青素含量大幅降低,可見(jiàn), SA在雨生紅球藻蝦青素生物合成過(guò)程中起著重要作用。

        2.6 MLT誘導(dǎo)對(duì)dxs基因表達(dá)量的影響

        用qRT-PCR方法檢測(cè)不同誘導(dǎo)時(shí)間內(nèi), 10 μmol/L MLT誘導(dǎo)組和對(duì)照組間雨生紅球藻蝦青素相關(guān)合成基因dxs的表達(dá)量(圖6), 結(jié)合蝦青素含量變化趨勢(shì), 10 μmol/L MLT處理組dxs基因表達(dá)量第7天時(shí)顯著高于對(duì)照組, 第9天時(shí), 達(dá)到最高, 是對(duì)照組的11.7倍, 蝦青素的含量第7天開(kāi)始明顯高于對(duì)照組,第13天時(shí)達(dá)到最高31.32 mg/g, 此時(shí)dxs基因的表達(dá)量是對(duì)照組的2.74倍。

        3 討論

        圖3 MLT和ROS抑制劑對(duì)雨生紅球藻內(nèi)ROS水平和蝦青素含量的影響Fig. 3 Effect of MLT and a ROS inhibitor on the ROS levels and astaxanthin content of H. pluvialis during induction process

        圖4 MLT和NO抑制劑對(duì)細(xì)胞內(nèi)NO濃度和蝦青素含量的影響Fig. 4 Effects of MLT and NO inhibitor on the NO levels and astaxanthin content of H. pluvialis during induction process

        圖5 MLT和SA抑制劑對(duì)細(xì)胞內(nèi)SA水平和蝦青素含量的影響Fig. 5 Effects of MLT and Salicylic acid (SA) inhibitor on the SA levels and astaxanthin content of H. pluvialis during induction process

        本文探究了在高光照、氮缺陷的脅迫條件下,外源添加不同濃度MLT對(duì)雨生紅球藻蝦青素積累的影響及其可能的調(diào)控機(jī)制。在10 μmol/L MLT處理下, 藻細(xì)胞生物量較對(duì)照組無(wú)顯著性變化。這與Tal等[22]的研究結(jié)果相似, 添加MLT對(duì)萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)藻細(xì)胞的生長(zhǎng)沒(méi)有明顯影響; Li等[19]研究表明外源添加褪黑素對(duì)單針藻生長(zhǎng)也無(wú)顯著性影響。此外, 本研究中外源添加MLT可提高雨生紅球藻中蝦青素的含量, 在10 μmol/L MLT誘導(dǎo)條件下藻細(xì)胞中蝦青素的積累量可達(dá)31.32 mg/g, 與其他文章所述的雨生紅球藻中蝦青素含量相比優(yōu)勢(shì)較明顯[23,24]。添加100 mg/L的褪黑素處理葡萄(Vitis vinifera)幼果, 可引起葡萄果實(shí)內(nèi)源褪黑素積累, 促進(jìn)果實(shí)膨大[25]。外源添加褪黑素可提高高溫脅迫下黃瓜幼苗抗壞血酸代謝活性[26], 增強(qiáng)ROS清除能力[27], 提高氮代謝能力[28], 促進(jìn)高溫逆境下黃瓜幼苗的生長(zhǎng)。另一方面, 在非生物脅迫條件下, MLT可通過(guò)多種機(jī)制調(diào)控植物脅迫應(yīng)答, 清除過(guò)剩ROS及調(diào)控信號(hào)分子備受關(guān)注[29]。

        圖6 MLT對(duì)dxs基因表達(dá)量的影響Fig. 6 Effects of MLT on the transcriptional expression level of dxs during induction process

        有研究表明ROS在細(xì)胞內(nèi)次生代謝產(chǎn)物積累中起著雙重作用, 一方面, 能破壞細(xì)胞的生物大分子, 另一方面, ROS產(chǎn)生能促進(jìn)雨生紅球藻和杜氏藻中β-胡蘿卜素的積累[14,30,31]。在本研究中, 高光照和氮缺陷條件引起了細(xì)胞內(nèi)ROS的迸發(fā), MLT作為抗氧化劑緩解了ROS的急劇增加, 在一定程度上保護(hù)了細(xì)胞內(nèi)的生物大分子, 同時(shí)誘發(fā)了細(xì)胞內(nèi)蝦青素大量合成。此外, ROS的產(chǎn)生可能激活機(jī)體多種抗氧化系統(tǒng)進(jìn)而調(diào)控ROS水平, 保持ROS產(chǎn)生與清除的平衡。在高等植物中, 抗性受多重信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控, 其中SA和NO是重要的信號(hào)分子。Shi等[32]研究發(fā)現(xiàn), 外源添加MLT能提高擬南芥中NO和SA含量, 進(jìn)而增加其抗性相關(guān)基因表達(dá)量, 表現(xiàn)為抗病性提高, 而雨生紅球藻正是通過(guò)大量積累蝦青素來(lái)應(yīng)對(duì)不利環(huán)境的[33,34]。在10 μmol/L MLT誘導(dǎo)雨生紅球藻時(shí), 下調(diào)了ROS水平, 上調(diào)了NO、SA含量, 促進(jìn)了蝦青素的積累。此外, Ková?ik等[35]發(fā)現(xiàn)向Coccomyxa subellipsoidea中添加抗氧化劑維生素C降低了ROS水平, 提高了NO的含量, 進(jìn)而提高了藻細(xì)胞對(duì)非生物脅迫的耐受性。Gao等[36]外源添加SA促進(jìn)了雨生紅球藻中蝦青素的積累。可見(jiàn), 褪黑素可能是通過(guò)調(diào)控藻細(xì)胞內(nèi)ROS、NO和SA的含量來(lái)促進(jìn)蝦青素的積累的。為了驗(yàn)證上述假設(shè), 本試驗(yàn)在10 μmol/L MLT處理組的基礎(chǔ)上分別添加ROS、NO和SA抑制劑, 發(fā)現(xiàn)ROS、NO和SA水平受到明顯抑制, 蝦青素的積累量顯著降低。可見(jiàn)信號(hào)分子ROS、NO和SA均參與蝦青素的生物合成。

        諸多報(bào)道顯示外源添加一些植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑,蝦青素大量積累往往伴隨著相關(guān)生物合成基因表達(dá)水平的提高。添加赤霉素和茉莉酸甲酯可顯著提高dxs基因表達(dá)水平, 同時(shí)提高了蝦青素的產(chǎn)量[37,38],dxs酶基因是蝦青素生物合成途徑中第一個(gè)限速酶(1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶, DXS)調(diào)控基因, 對(duì)比dxs基因表達(dá)量與蝦青素積累量可知, 二者雖不具有同步性, 但dxs基因表達(dá)量增加后藻細(xì)胞蝦青素大量積累, 可能是由于MLT誘導(dǎo)提高了dxs基因的表達(dá)量, DXS活性增高, 從而促進(jìn)了丙酮酸和甘油醛-3-磷酸(GA3P)向DOXP的轉(zhuǎn)化, 為后續(xù)蝦青素的大量合成提供了足夠的底物, 進(jìn)而提高了蝦青素的積累量。

        綜上所述, 在高光照聯(lián)合氮缺陷培養(yǎng)條件下,誘發(fā)了雨生紅球藻細(xì)胞中的ROS的迸發(fā), 添加MLT時(shí)能清除細(xì)胞內(nèi)過(guò)多的ROS, 保證了細(xì)胞的正常代謝活性; 另一方面, 褪黑素增加SA和NO的水平, 可能通過(guò)調(diào)控SA和NO依賴抗性途徑增強(qiáng)雨生紅球藻對(duì)脅迫條件的響應(yīng), 上調(diào)蝦青素生物合成酶基因dxs的表達(dá), 進(jìn)而促進(jìn)蝦青素的合成。本研究表明, 添加適量濃度的MLT有利于雨生紅球藻中蝦青素的積累, 當(dāng)MLT濃度為10 μmol/L MLT時(shí), 藻細(xì)胞中蝦青素可達(dá)31.32 mg/g; 此外, 本研究中MLT誘導(dǎo)雨生紅球藻中蝦青素的大量積累, 可能與其調(diào)控細(xì)胞內(nèi)ROS、SA、NO及dxs基因表達(dá)有關(guān), 后續(xù)分子生物學(xué)機(jī)制需進(jìn)一步探究。

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