劉棋琴 羊 芃 馬明婕 周麗亞 李亞鶴 楊 銳,

(1. 寧波大學(xué)海洋學(xué)院, 寧波 315211; 2. 寧波大學(xué)浙江省海洋生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 寧波 315211)

近年來, 海水養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅猛, 沿海養(yǎng)殖場(chǎng)中池塘養(yǎng)殖的廢水排放量與日俱增, 導(dǎo)致近岸海水的富營養(yǎng)化日益嚴(yán)重[1], 其主要污染指標(biāo)為無機(jī)氮和活性磷酸鹽[2]。水體惡化導(dǎo)致更多災(zāi)難性環(huán)境事件發(fā)生[3], 嚴(yán)重影響了海水養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展及海洋生態(tài)安全[4]。富營養(yǎng)化水體的治理已成為當(dāng)今世界性難題[5]。國內(nèi)外學(xué)者一致認(rèn)為, 大型海藻具有極佳的水體凈化能力, 并具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值, 是進(jìn)行養(yǎng)殖污水處理和富營養(yǎng)化水體修復(fù)的有效方式[6—9]。20世紀(jì)70年代大型海藻作為生物濾器凈化水體開始發(fā)展, 后來被很多專家學(xué)者所重視, 逐漸發(fā)展并完善了大型海藻與魚、蝦、貝等混養(yǎng)的綜合生態(tài)養(yǎng)殖模式, 篩選合適的藻類和凈水處理工藝是利用大型海藻進(jìn)行污染水體的生物修復(fù)亟待解決的問題[10]。

海洋藻類是海洋初級(jí)生產(chǎn)力的重要組成, 可利用CO2和氮、磷等營養(yǎng)素進(jìn)行光合作用。近海大型海藻的大規(guī)模養(yǎng)殖可以消耗生活海區(qū)大量C、N、P等元素, 改變了海區(qū)的物質(zhì)循環(huán); 有的甚至可以起到了控制赤潮延緩海域富營養(yǎng)化的作用。至今為止, 關(guān)于大型海藻用于水體營養(yǎng)鹽吸收的研究有很多[11—15], 同時(shí), 對(duì)不同營養(yǎng)鹽的吸收速率受環(huán)境因素如溫度、光照強(qiáng)度的影響, 并表現(xiàn)出一定的種間差異[13,14,16,17], 其次, 即使是同一藻種, 對(duì)氨氮、硝氮等不同營養(yǎng)鹽的吸收對(duì)環(huán)境因素的響應(yīng)也不同,如石莼、鐵釘菜、蜈蚣藻對(duì)-N[18]的吸收速率在低溫5℃時(shí)最高, 但對(duì)-N的吸收則在15℃時(shí)最高[18]?？紤]到水產(chǎn)養(yǎng)殖及運(yùn)用大型海藻進(jìn)行廢水處理的季節(jié)性, 這其中溫度是主要的影響因素,結(jié)合浙江當(dāng)?shù)匮睾ｐB(yǎng)殖廢水的實(shí)際狀況, 本實(shí)驗(yàn)以常見大型經(jīng)濟(jì)海藻裂片石莼(Ulva fasciata)、腸滸苔(Ulva intestinalis)、龍須菜(Gracilaria lemaneaformis)、壇紫菜(Pyropia haitanensis)為材料, 通過評(píng)估不同溫度下它們的N、P吸收效率、生長及光合生理特性等, 獲得不同溫度下N、P去除效率高、生理指標(biāo)相對(duì)較優(yōu)的藻種, 優(yōu)化養(yǎng)殖廢水處理模式, 為實(shí)地實(shí)踐提供備選藻類和處理方案。

1 材料與方法

1.1 材料

裂片石莼、腸滸苔、龍須菜、壇紫菜于2016年采于溫州市平陽縣鰲江鎮(zhèn)附近海域(120°20′E,27°35′N)。挑選鮮活健康的藻體, 用消毒海水清洗,軟毛刷除凈表面附著物, 并用0.7%的KI溶液浸泡10min, 除去雜藻和細(xì)菌, 然后用滅菌海水沖洗兩次備用。實(shí)驗(yàn)開始前, 每種藻取3 g至1000 mL燒杯中在光照培養(yǎng)箱中充氣預(yù)培養(yǎng)1d(培養(yǎng)光強(qiáng)100 μmol/(m2·s),光周期為12h L∶12h D), 溫度與實(shí)驗(yàn)溫度一致。預(yù)培養(yǎng)海水為人工配制[19], 鹽度為30。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

將裂片石莼、龍須菜、腸滸苔、壇紫菜放置在富營養(yǎng)化水體中, 分別在15、 20、 25、 30℃條件下光照培養(yǎng)48h。培養(yǎng)過程中于0、6、12、24、36、48h進(jìn)行水質(zhì)檢測(cè), 培養(yǎng)結(jié)束后測(cè)定海藻生長速率及葉綠素?zé)晒鈪?shù)。

培養(yǎng)條件溫度梯度設(shè)置15、 20、 25、 30℃,在人工海水中依次加入NaNO2、NaNO3、NH4Cl、NaH2PO4藥品, 培養(yǎng)基中N、P終濃度為C(-N)=10.87 μmol/L, C(-N)=70.97 μmol/L, C(-N)=100 μmol/L, C(-P)=8.46 μmol/L。培養(yǎng)時(shí), 取(1±0.005) g的藻體(濕重)置于1 L 的燒杯中, 初始培養(yǎng)液體積為832 mL, 培養(yǎng)條件同預(yù)培養(yǎng)條件。

水樣指標(biāo)測(cè)定培養(yǎng)后0、6、12、24、36、48h進(jìn)行水質(zhì)取樣, 測(cè)定培養(yǎng)基中的N、P含量。對(duì)-N的分析采用萘乙二胺分光光度法, 對(duì)-N分析采用次溴酸鹽氧化法, 對(duì)-P的分析采用磷鉬藍(lán)分光光度法, 對(duì)-N分析采用鋅鎘還原法。檢測(cè)方法參照GB/T 12763.4-2007《海洋調(diào)查規(guī)范第四部分: 海洋化學(xué)要素調(diào)查》中的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

生長速率的測(cè)定培養(yǎng)前和培養(yǎng)后進(jìn)行藻體鮮重的測(cè)定。用吸水紙吸干藻體表面的水分, 使用電子天平稱量藻體鮮重。相對(duì)生長速率計(jì)算公式為(RGR, %/d)= 100×(LnWn–LnWn–1)/(tn–tn–1),Wn–1、Wn分別為為tn–1、tn時(shí)的藻體鮮重。

葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定在每個(gè)條件下培養(yǎng)48h后, 采用葉綠素調(diào)制熒光儀(water PAM)進(jìn)行熒光參數(shù)的測(cè)定。具體操作如下: 不同處理的樣品在黑暗條件下處理15min, 在培養(yǎng)光強(qiáng)條件下(光化光接近培養(yǎng)光強(qiáng))進(jìn)行葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)曲線的測(cè)定,獲得最大(Fv/Fm)及培養(yǎng)光強(qiáng)下的有效光化學(xué)效率(Fv′/Fm′)。設(shè)置8個(gè)光強(qiáng)梯度[114、167、257、379、570、861、1218及1692 μmol/(m2·s)]進(jìn)行快速光響應(yīng)曲線(RLC)的測(cè)定, 每個(gè)光強(qiáng)梯度持續(xù)時(shí)間為10s, 飽和脈沖為5000 μmol·photons/(m2·s)。相對(duì)電子傳遞速率(rETR)通過以下的公式計(jì)算:其中a、b、c為擬合參數(shù), 并以此計(jì)算出光能利用效率α、最大電子傳遞速率rETRmax和飽和光強(qiáng)Ek, 計(jì)算公式如下[20]:

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 7.0和SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析, 用t檢驗(yàn)法(t-tests)方差分析檢測(cè)平均數(shù)之間的差異(P), 以P＜0.05作為差異的顯著性水平。

圖1 不同溫度下4種藻類的生長情況Fig. 1 RGR of 4 macroalgae species of different temperatures

2 結(jié)果

2.1 藻類生長

在15—25℃內(nèi), 溫度變化對(duì)裂片石莼生長無顯著影響(P＞0.05)。龍須菜、壇紫菜和腸滸苔的生長在不同溫度下差異顯著(P＜0.05), 最高相對(duì)生長率均出現(xiàn)在20℃與25℃, 溫度為15℃和30℃時(shí)相對(duì)生長率明顯降低, 壇紫菜在30℃時(shí)甚至出現(xiàn)負(fù)增長,說明高溫對(duì)壇紫菜的正常生長造成威脅。4種藻中腸滸苔生長得最快, 20℃時(shí)每天的相對(duì)生長率高達(dá)24%, 20℃與25℃時(shí)生長情況明顯優(yōu)于其他3種藻類。

2.2 營養(yǎng)鹽吸收情況

對(duì)比分析(圖2)顯示: 在15—30℃內(nèi), 腸滸苔和裂片石莼對(duì)-N的吸收能力明顯優(yōu)于龍須菜和壇紫菜, 綠藻培養(yǎng)基中的-N在12h內(nèi)均基本被吸收完畢, 且腸滸苔對(duì)-N吸收能力略優(yōu)于裂片石莼(P＞0.05)。而在不同溫度下龍須菜與腸滸苔水體中-N在48h內(nèi)也基本被藻體吸收, 說明4種海藻-N的吸收能力均較佳。15℃時(shí)龍須菜對(duì)-N的吸收速率明顯降低, 說明低溫對(duì)其-N吸收效果造成明顯限制。

圖2 不同溫度處理下氨氮濃度隨時(shí)間變化曲線Fig. 2 The changes of -N concentration in culture medium under different temperatures

圖3 不同溫度處理下活性磷濃度隨時(shí)間變化曲線Fig. 3 The changes of -P concentration in culture medium under different temperatures

圖4 不同溫度處理下硝氮濃度隨時(shí)間變化曲線Fig. 4 The changes of -N concentration in culture medium under different temperatures

圖5 不同溫度處理下亞硝氮濃度隨時(shí)間變化曲線Fig. 5 The changes of -N concentration in culture medium under different temperatures

本研究發(fā)現(xiàn), 4種藻類對(duì)水體中的營養(yǎng)鹽吸收均十分顯著, 按照營養(yǎng)鹽吸收能力高低排序?yàn)? 腸滸苔＞裂片石莼＞壇紫菜＞龍須菜; 裂片石莼和腸滸苔在不同溫度下對(duì)水體中各營養(yǎng)鹽吸收效果較好,具有去除N、P能力強(qiáng)、適溫范圍廣的特點(diǎn); 其中腸滸苔對(duì)-N、-N、-P的吸收能力均為最佳; 在15℃和20℃環(huán)境下, 壇紫菜對(duì)-N的吸收能力十分顯著, 但其營養(yǎng)鹽吸收受高溫限制;龍須菜對(duì)-N吸收能力強(qiáng), 對(duì)其他營養(yǎng)鹽吸收能力相對(duì)較弱, 且低溫會(huì)對(duì)其吸收效果造成明顯限制。

2.3 熒光參數(shù)

隨著溫度升高,ETRmax與Ik均呈先上升后下降的趨勢(shì), 25℃時(shí), 裂片石莼、龍須菜、壇紫菜與腸滸苔的rETRmax顯著增高, 在15℃和30℃時(shí)數(shù)值相對(duì)較低; 溫度對(duì)其表觀光能利用效率的影響不顯著(P＞0.05)(表1)。溫度對(duì)裂片石莼和腸滸苔的最大(Fv/Fm)及有效光化學(xué)效率(Fv′/Fm′)無明顯影響, 說明這2種藻溫度耐受范圍較廣。在15℃培養(yǎng)時(shí), 龍須菜的Fv/Fm及Fv′/Fm′均降低; 而30℃時(shí)不影響龍須菜Fv/Fm, 但明顯抑制了Fv′/Fm′。壇紫菜在25℃時(shí)Fv/Fm和Fv′/Fm′顯著增高, 至30℃時(shí)Fv/Fm和Fv′/Fm′均迅速下降(圖6), 說明30℃對(duì)壇紫菜的PSII系統(tǒng)造成傷害。總體來講, 腸滸苔與裂片石莼rETRmax與Ik數(shù)值較高, 與Fv/Fm與Fv′/Fm′數(shù)值表現(xiàn)一致。

表1 不同溫度下4種大型海藻的相對(duì)電子傳遞速率與光強(qiáng)關(guān)系的最佳擬合參數(shù)Tab. 1 The best fitting parameters derived from relative electron transport rate (rETR) v.s. irradiance curve of four macroalgae species under different temperatures

圖6 不同溫度處理下最大光化學(xué)量子產(chǎn)量(Fv/Fm, A)及有效光化學(xué)量子產(chǎn)量(Fv′/Fm′, B) (P＜0.5)Fig. 6 Effects of different temperatures on Fv/Fm and Fv′/Fm′

3 討論

3.1 溫度對(duì)大型海藻營養(yǎng)鹽吸收的影響

藻類對(duì)營養(yǎng)鹽的吸收受溫度的影響, 溫度是控制大型海藻氮吸收的重要因子, 溫度對(duì)呼吸作用及光合作用暗反應(yīng)的酶活性有顯著的影響[21]。大型海藻對(duì)營養(yǎng)鹽的吸收效果在一定的溫度范圍內(nèi), 過高或過低均不利于其對(duì)營養(yǎng)鹽的吸收, 這主要是由于在低溫條件下, 藻體參與光合作用暗反應(yīng)的酶活性較低, 產(chǎn)生的用來還原硝氮鹽的底物也較缺乏,導(dǎo)致營養(yǎng)鹽的吸收速率降低, 而在高溫條件下, 藻體的呼吸作用顯著增加, 用于生長的能量也相對(duì)較少, 降低藻體的生長, 進(jìn)而減少對(duì)營養(yǎng)鹽的吸收[22,23]。有研究表明, 大型海藻對(duì)營養(yǎng)鹽吸收可分為起始的短期快速吸收, 內(nèi)部營養(yǎng)鹽控制的穩(wěn)定吸收和外界營養(yǎng)鹽控制吸收在內(nèi)的3個(gè)階段[24,25], 這一發(fā)現(xiàn)解釋了本實(shí)驗(yàn)-N與-P濃度變化曲線中, 開始6h內(nèi)培養(yǎng)基中營養(yǎng)鹽濃度迅速下降其后逐漸趨于平緩的現(xiàn)象(圖2、圖3)。-N和-N被認(rèn)為是大型海藻生長最重要的氮源, 但一般認(rèn)為前者更容易吸收, 在-N 將近耗盡之后, 藻體開始利用-N[26], 因此在本實(shí)驗(yàn)中-N的濃度變化在初始階段減少的趨勢(shì)相對(duì)較緩。-N在4種藻類培養(yǎng)基中分解速度最慢, 這是由于-N為-N與-N的氧化中間態(tài), 轉(zhuǎn)換過程受水體中微生物活動(dòng)影響, 是不穩(wěn)定的形態(tài), 因此-N在水體中存在時(shí)間較長[27]。

3.2 溫度對(duì)藻類生長及光合作用的影響

溫度是影響藻類生長發(fā)育, 也是影響植物生理成分的重要因素[28], 研究在不同溫度條件下葉綠素?zé)晒獾奶匦? 能夠指示出藻類光合系統(tǒng)的溫度適宜和抑制范圍[29]。在本研究中, 裂片石莼具有較高的適溫能力, 壇紫菜對(duì)高溫的耐受性相對(duì)較弱。腸滸苔的生長速率在4種藻類中最高, 且在不同溫度下均維持較好的生長狀況(圖1), 已有的研究發(fā)現(xiàn), 在我國由滸苔(Ulva prolifera)引發(fā)的綠潮事件中, 往往混有腸滸苔, 腸滸苔作為綠潮物種之一, 在5—30℃內(nèi)都可以存活, 具有旺盛的生長力[30,31]。因此利用腸滸苔進(jìn)行養(yǎng)殖污水處理時(shí)應(yīng)注意水域封閉性, 避免造成生態(tài)污染。

龍須菜、壇紫菜、腸滸苔在20℃與25℃時(shí)生長較快, 15℃與30℃生長受抑制。這可能是由于在適宜溫度范圍內(nèi), 一定程度的氣溫升高能夠加快藻類的代謝, 促進(jìn)藻類的生長, 一旦超過這個(gè)范圍, 就會(huì)引起藻體同化和異化作用減弱、水分和營養(yǎng)吸收減慢、酶活性降低, 藻類光合作用受到抑制, 進(jìn)而阻礙了藻類的正常生長[32,33]。

高溫30℃對(duì)龍須菜Fv/Fm影響不顯著, 但顯著降低其Fv′/Fm′, 且該溫度下其生長速率也明顯下降(表1、圖6), 這可能是在30℃條件下, 溫度脅迫阻礙PSII的電子傳遞, 使光合作用器官受氧化的風(fēng)險(xiǎn)增強(qiáng), 這種氧化作用導(dǎo)致PSII系統(tǒng)的慢性損傷, 導(dǎo)致葉綠素?zé)晒鈪?shù)改變, 但并未使PSII系統(tǒng)完全失活[35]。盡管龍須菜是抗高溫品種, 但在30℃條件下其部分生理指數(shù)有顯著降低, 證明該溫度對(duì)龍須菜已經(jīng)造成一定脅迫。

3.3 利用藻類進(jìn)行污水處理的方案

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示: 腸滸苔和裂片石莼適應(yīng)溫度范圍大, N、P吸收能力強(qiáng), 是利用大藻凈化污水實(shí)地應(yīng)用的良好選擇。尤其腸滸苔對(duì)-N的吸收能力顯著, 處理高-N水體時(shí)可優(yōu)先考慮。由于不同藻類吸收營養(yǎng)鹽的特性不同, 在利用大型海藻凈化養(yǎng)殖廢水時(shí), 要“因地制宜”, 根據(jù)實(shí)際情況選擇適宜凈水材料及方案。例如, 對(duì)蝦工廠化養(yǎng)殖廢水中-N高達(dá)TN的60%—70%, 養(yǎng)殖溫度為23℃至27℃之間[35], 因此, 選擇腸滸苔與裂片石莼, 利用其耐受高溫,-N吸收能力強(qiáng)的特點(diǎn)進(jìn)行廢水處理會(huì)提高效率; 而因?yàn)閴喜瞬荒褪芨邷? 龍須菜-N吸收能力差, 所以二者不在考慮范圍內(nèi)。在蘇州地區(qū)南美白對(duì)蝦、塘羅氏沼蝦、河蟹池塘養(yǎng)殖中, 養(yǎng)殖水中-N濃度較高[36], 腸滸苔對(duì)-N的吸收能力最佳, 可優(yōu)先考慮。2012—2013年調(diào)查發(fā)現(xiàn), 流沙灣海水養(yǎng)殖區(qū)溶解無機(jī)磷(DIP)濃度較低(普遍小于0.05 mg/L), 而溶解無機(jī)氮(DIN)濃度則普遍較高, 尤其是春季(0.692—3.067 mg/L)和夏季(0.521—0.979 mg/L), 水體屬于明顯的P 限制,該地區(qū)常年養(yǎng)殖海域均處于嚴(yán)重的富營養(yǎng)化狀態(tài),且春夏季的有機(jī)污染嚴(yán)重[37]。基于當(dāng)?shù)貭I養(yǎng)鹽成分特點(diǎn), 可采用耐受高溫且P吸收能力較差的龍須菜進(jìn)行海區(qū)修復(fù)。

值得注意的是, 裂片石莼與腸滸苔在36h內(nèi)已達(dá)到凈水目的, 龍須菜和壇紫菜在48h內(nèi)培養(yǎng)基中的營養(yǎng)鹽濃度也達(dá)到極低水平, 這說明在實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)考慮到換水周期(一般情況下36—48h即可更換水體)或采用流通循環(huán)式的培養(yǎng)模式, 以達(dá)到既能去除N、P等營養(yǎng)鹽, 又能促進(jìn)大型海藻的生長并避免因藻體腐爛造成的二次污染的目的。當(dāng)然,不同藻類凈水效果不同, 因此可根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整凈水工藝。另外, 溫度脅迫將造成大型海藻生長效率與同化作用減弱, 影響凈水效果, 并且大型海藻具有一定的生長季節(jié), 在夏秋季節(jié)利用大型海藻進(jìn)行養(yǎng)殖污水處理將存在一定的局限性。發(fā)掘抗高溫藻類, 利用多種海藻輪作, 深入研究大型藻類與魚、蝦、貝類等互利機(jī)制是利用大型海藻進(jìn)行海水修復(fù)的重要趨勢(shì)。