楊 爽,白 雪,孟 鑫

(錦州醫(yī)科大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧錦州 121000)

隨著大眾消費觀念的提升,奶制品已成為人們?nèi)粘Ｉ攀车闹匾M成部分,占據(jù)著我國消費市場較大比重,人們對奶制品風(fēng)味需求日益上升,給奶制品生產(chǎn)者提出新的挑戰(zhàn)。奶制品中奶香味物質(zhì)的重要成分來源于脂肪酸,在一定范圍內(nèi),脂肪酸含量越高,奶制品香氣越強烈[1],由于脂肪酶可以促進(jìn)脂肪酸的生成[2],近年來受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。Verhaeghe D等[3]通過酶解乳脂肪從而制備奶香味物質(zhì)。林偉峰等[4]發(fā)現(xiàn)在稀奶油-乳清發(fā)酵體系添加外源脂肪酶,促進(jìn)羧酸類物質(zhì)增加,產(chǎn)生酯類,改善體系風(fēng)味。但到目前為止,報道使用的多為進(jìn)口外源脂肪酶制劑,價格較高,而作為食品級解脂酶的內(nèi)源性脂肪酶不僅可以有效改善食品風(fēng)味,而且來源于動物本身,安全性更高[5]。本實驗室前期已采用雙水相體系萃取豬肉內(nèi)源性脂肪酶并將其應(yīng)用于肉制品[6]與奶酪[7]中,經(jīng)鑒定對肉品與奶酪的風(fēng)味均有改善,但對其它奶制品風(fēng)味的影響尚不明確,因此本文挑選商場中常見的奶制品:凝固型酸奶與奶貝,向其中添加內(nèi)源性豬肉脂肪酶,利用電子鼻對處理前后的奶制品風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行識別,運用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HS-SPME-GC-MS)對風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行鑒定,為進(jìn)一步促進(jìn)內(nèi)源脂肪酶在奶制品中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

內(nèi)源性豬肉脂肪酶酶液 采用雙水相法從豬肉(肥肉)中萃取脂肪酶酶液,參照文獻(xiàn)[8]提取方法并做簡單修改,萃取條件為:PEG2000濃度為32%,(NH4)2SO4濃度為32%,pH為6.5;凝固型酸奶(老酸奶)、奶貝(伊利) 購于錦州市新瑪特超市。

PEN3型電子鼻 德國AIRSENSE公司;75 μm CAR/PDMS SPME萃取頭 上海楚定分析儀器有限公司;7890N/5975 GC-MS Agilent公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備

1.2.1.1 酸奶樣品的制備 取凝固型酸奶樣品與脂肪酶液各10 mL于燒杯中混勻成乳濁狀,室溫下靜置30 min后，85 ℃滅酶3 min備用(處理組)?？瞻捉M酶液用雙蒸水替代。

1.2.1.2 奶貝樣品的制備 取1 g奶貝與10 mL脂肪酶液充分混勻于燒杯中,室溫下靜置30 min后，85 ℃滅酶3 min備用(處理組)?？瞻捉M酶液用雙蒸水替代。

1.2.2 電子鼻檢測 分別取10 mL處理后酸奶及奶貝樣品于燒杯中,封口膜封口靜置30 min，使其充分酶解進(jìn)行電子鼻氣味錄入,每組樣品3個平行,共測6次。本次實驗設(shè)定電子鼻信號采集時間:50 s,清洗時間:120 s。本次實驗所使用電子鼻傳感器性能描述見表1。

表1 PEN3型便攜式電子鼻傳感器性能描述

1.2.3 GC-MS分析實驗方法 參照文獻(xiàn)[9]方法略作修改。

1.2.3.1 固相微萃取 分別稱取5 mL由1.2.1.1與1.2.1.2處理過的凝固型酸奶與奶貝樣品置于20 mL頂空瓶中,加入3 mL飽和氯化鈉溶液及磁轉(zhuǎn)子,用聚四氟乙烯隔墊密封,于45 ℃磁力攪拌器中加熱平衡10 min,用 DVB/CAR/PDMS 50/30 μm萃取頭(于270 ℃活化60 min)頂空吸附30 min。將萃取頭插入GC進(jìn)樣口,解吸5 min。每個樣品重復(fù)實驗3次。

1.2.3.2 氣相色譜條件 HP-5MS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);進(jìn)樣口溫度為250 ℃,不分流模式進(jìn)樣;載氣為He,流速1.0 mL/min;程序升溫,柱初溫57 ℃,保持3 min,以3 ℃/min升至100 ℃,再以5 ℃/min升至260 ℃,保持10 min;分流比5∶1。

1.2.3.3 質(zhì)譜條件 色譜-質(zhì)譜接口溫度280 ℃,離子源溫度230 ℃,四級桿溫度150 ℃;離子化方式:EI;電子能量70 eV;質(zhì)量掃描范圍30～550 m/z。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

1.2.4.1 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)差異性分析采用SPSS 17.0方差分析。

1.2.4.2 PCA分析 PCA分析取穩(wěn)定后第47～49 s這3 s的電子鼻傳感器數(shù)值信息,使用電子鼻系統(tǒng)自帶軟件Winmuster進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4.3 GC-MS數(shù)據(jù)分析 樣品中揮發(fā)性成分的定性分析采用計算機譜庫(NIST11/Wiley7.0)進(jìn)行檢索,并使用C8～C20正構(gòu)烷烴的保留時間，計算各個色譜峰的保留指數(shù),來確認(rèn)揮發(fā)性物質(zhì)的化學(xué)組成。揮發(fā)性成分的定量分析采用峰面積歸一化法。

2 結(jié)果與分析

2.1 電子鼻檢測內(nèi)源性豬肉脂肪酶對奶制品風(fēng)味影響

如圖1所示內(nèi)框線為未經(jīng)脂肪酶處理的奶制品雷達(dá)圖,外框線為脂肪酶處理后的奶制品雷達(dá)圖。圖1中酸奶及奶貝樣品經(jīng)脂肪酶處理前后風(fēng)味輪廓均有不同程度的改變,與未經(jīng)脂肪酶處理的奶制品相比,經(jīng)脂肪酶處理的酸奶樣品在7號W2W、9號W2S、3號W3C、2號W5S四個傳感器增加量較高,差異顯著(p<0.05);奶貝樣品經(jīng)脂肪酶處理后,除4號W6S與10號W3S這兩個傳感器相對電阻值無明顯改變外,其它八個傳感器的響應(yīng)值均大幅度增加,差異顯著(p<0.05)。電子鼻結(jié)果表明，奶制品樣品經(jīng)脂肪酶酶解后其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量增加,證明脂肪酶酶解乳脂肪后產(chǎn)生了更多的揮發(fā)性成分。

圖1 奶制品樣品經(jīng)內(nèi)源豬肉脂肪酶處理前后雷達(dá)圖比較

同時采用PCA(主成分分析)方法對豬肉內(nèi)源性脂肪酶處理前后奶制品中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析(圖2),圖中的每個橢圓代表同批次奶制品風(fēng)味的數(shù)據(jù)采集點[10]。從圖2中第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)兩個坐標(biāo)軸上可以看出,兩種奶制品樣品間差異顯著。其中酸奶樣品中貢獻(xiàn)率總和為99.92%,奶貝樣品中貢獻(xiàn)率總和為99.93%,兩種奶制品均大于95%以上,這說明PC1和PC2有足夠的信息來代表樣品的揮發(fā)性風(fēng)味的主要特征。這表明:經(jīng)內(nèi)源豬肉脂肪酶處理前后的奶制品在風(fēng)味上存在差別,電子鼻能有效地區(qū)分內(nèi)源脂肪酶處理前后奶制品樣品的風(fēng)味特征。

圖2 處理前后的奶制品樣品響應(yīng)值PCA分析圖

通過電子鼻可以從宏觀上比較出，經(jīng)脂肪酶處理后,奶制品樣品整體風(fēng)味成分的顯著增加,為進(jìn)一步確定內(nèi)源性豬肉脂肪酶對奶制品風(fēng)味作用的具體成分,采用GC-MS進(jìn)行分析檢測和鑒定。

2.2 GC-MS檢測內(nèi)源脂肪酶對奶制品風(fēng)味的影響

通過HS-SPME-GC-MS技術(shù)檢測內(nèi)源性豬肉脂肪酶對酸奶及奶貝風(fēng)味的影響,分析匹配度大于80%的風(fēng)味成分,圖3為經(jīng)脂肪酶處理前后的酸奶與奶貝揮發(fā)性風(fēng)味成分總離子流色譜圖,如表2、表3所示酸奶樣品中共檢測出揮發(fā)性物質(zhì)54種,奶貝中共檢測出揮發(fā)性物質(zhì)32種。將兩種奶制品所有揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)歸類如圖4?？傮w來說,酸奶中的主要風(fēng)味物質(zhì)有烴類、雜環(huán)和芳香族類、有機酸類、酯類等化合物,奶貝中的主要風(fēng)味物質(zhì)有酸類和酯類、烴類、醛酮類、芳香族類等。

圖3 GC-MS聯(lián)用分析兩種奶制品樣品揮發(fā)性成分總離子流色譜圖

表2 GC-MS檢測脂肪酶處理前后凝固型酸奶樣品的風(fēng)味成分

續(xù)表

表3 GC-MS檢測脂肪酶處理前后奶貝樣品的風(fēng)味成分

續(xù)表

烴類物質(zhì)在奶貝與酸奶樣品中相對含量占比重很大,并且普遍存在于奶制品中,但烴類物質(zhì)具有較高的芳香閾值,對于奶制品的整體風(fēng)味貢獻(xiàn)較小[11]。但一些芳香烴具有較強的芳香風(fēng)味[12]。經(jīng)過脂肪酶處理后，酸奶中雜環(huán)和芳香族化合物相對含量由20.15%增加為23.69%，奶貝中雜環(huán)和芳香族化合物相對含量由6.34%增加為11.36%。圖4結(jié)果顯示,酸奶與奶貝樣品中烴類物質(zhì)占總揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的含量較高,但檢測出的烷烴、烯烴類物質(zhì)主要為長鏈直鏈的烴,這類物質(zhì)的閾值較高,對奶制品的風(fēng)味貢獻(xiàn)較低。

圖4 兩種奶制品樣品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相對含量

奶制品的香氣主要來自于構(gòu)成乳脂肪的脂肪酸[13]。脂肪酸分解產(chǎn)物包括甲基酮類、內(nèi)酯類、酯類和二級醇類[14]。對奶香味貢獻(xiàn)較大的甲基酮類化合物可以由β-酮酸受熱脫羧生成,如2-戊酮、2-庚酮、2-壬酮、2-十一酮等[1,15]。經(jīng)過脂肪酶處理后，酸奶中醛酮類物質(zhì)相對含量由0.71%增加至0.95%，奶貝中醛酮類物質(zhì)相對含量由9.26%增加至13.22%?？瞻捉M奶貝中2-十一酮相對含量為2.53%,2-庚酮為2.91%,處理組奶貝2-十一酮含量3.46%,2-庚酮為3.99%,經(jīng)脂肪酶處理后產(chǎn)生奶香味的2-十一酮、2-庚酮占奶貝風(fēng)味物質(zhì)的比重明顯增加?？瞻捉M酸奶中2-壬酮相對含量為0.28%,處理后所占比重增加為0.36%。由于直鏈的醛、烷烯烴、酮、醇類風(fēng)味成分主要來自于脂類物質(zhì)的變化[16-17],奶制品中烴類物質(zhì)及醛酮類物質(zhì)的增加，表明脂肪酶能夠促進(jìn)乳脂肪的進(jìn)一步變化。

脂肪酶酶解奶制品就是將包含在三酰甘油酯中的中短鏈脂肪酸釋放出來,如以丁酸、己酸、辛酸和癸酸等[18],GC-MS結(jié)果顯示，酸奶樣品空白組有機酸含量27.21%,酯類物質(zhì)含量13.89%,處理組有機酸相對含量18.10%,酯類物質(zhì)含量18.12%;奶貝樣品空白組有機酸含量20.63%,酯類物質(zhì)含量30.39%,處理組有機酸相對含量10.25%,酯類物質(zhì)含量34.71%,經(jīng)脂肪酶處理后奶制品有機酸含量降低(p<0.05),酯類物質(zhì)相對含量增加,差異顯著(p<0.05)。這一結(jié)果也表明，在脂肪酶分解乳脂肪的過程中，大量的脂肪酸轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的酯類化合物[19],并且這類脂肪酸也是其他風(fēng)味物質(zhì)(如:甲基酮、醇、酯、醛等)的前體物質(zhì)[20]。

本實驗檢測出經(jīng)內(nèi)源豬肉脂肪酶處理后,對奶制品風(fēng)味有重要影響的雜環(huán)及芳香族化合物、酯類、醛酮類物質(zhì)相對含量增加,與文獻(xiàn)王蓓[21]、侯園園[22]使用外源脂肪酶酶解天然乳脂的物質(zhì)種類基本一致;林偉峰[4]研究發(fā)現(xiàn),稀奶油-乳清體系添加脂肪酶后,酸類及酯類含量增加,而本實驗檢測酸類物質(zhì)的含量減少,這可能與脂肪酸的轉(zhuǎn)化有關(guān)[23]。

3 結(jié)論

電子鼻檢測結(jié)果顯示,脂肪酶處理前后奶制品風(fēng)味有明顯的改變,并且經(jīng)脂肪酶處理后的奶制品每個傳感器的響應(yīng)值較處理前的空白組均有不同程度的增加,通過PCA分析電子鼻傳感器數(shù)據(jù)進(jìn)一步說明，利用電子鼻檢測經(jīng)內(nèi)源豬肉脂肪酶處理前后，奶制品風(fēng)味的可行性以及各組數(shù)據(jù)的采集點分散在不同的區(qū)域,每組樣品間揮發(fā)性風(fēng)味有明顯的差異。GC-MS檢測經(jīng)內(nèi)源脂肪酶處理前后的奶制品樣品揮發(fā)性成分主要為醛酮類、酯類、酸類、芳香族類和以及烴類物質(zhì)等,經(jīng)豬肉脂肪酶處理后,兩種奶制品在醛酮類、酯類、雜環(huán)和芳香族類化合物相對含量顯著增加(p<0.05)，奶制品樣品中呈現(xiàn)奶香味的揮發(fā)性物質(zhì)2-十一酮、2-庚酮、2-壬酮等相對含量有所提高,作為揮發(fā)性風(fēng)味前體物質(zhì)的有機酸類物質(zhì)相對含量降低,進(jìn)一步表明了內(nèi)源脂肪酶可以酶解乳脂肪產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì),有效改善奶制品的風(fēng)味。