楊旭潔，陳 捷，蔡 蓓，蘇真珍，吳曉娟，石明巧

(四川大學(xué)華西醫(yī)院實驗醫(yī)學(xué)科，成都 610041)

慢性乙型肝炎(CHB)嚴(yán)重危害人類健康，全球約有3.5億攜帶者，每年約50萬人感染乙型肝炎病毒(HBV)而病死。我國約有1.3億的HBV攜帶者，2 300萬CHB患者。HBV相關(guān)的肝臟疾病是造成終末期肝病的主要原因，而肝移植是終末期肝病唯一的有效治療手段。但移植后再次感染是嚴(yán)重影響肝移植成功率的因素，最終可導(dǎo)致移植物失去功能，快速發(fā)展至肝硬化和肝纖維化，所以監(jiān)測HBV感染者的免疫調(diào)控狀態(tài)，分析肝移植后感染復(fù)發(fā)的免疫標(biāo)志物尤為重要[1]。現(xiàn)探討肝移植后乙型肝炎復(fù)發(fā)與CHB患者可溶性免疫標(biāo)志物的差異，研究反映HBV感染的免疫新指標(biāo)。

有研究證實，HBV特異的細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)，輔助性T細(xì)胞T-helper cells (Th)是控制HBV病毒感染的關(guān)鍵免疫細(xì)胞，但持續(xù)攜帶HBV者無法正常發(fā)揮細(xì)胞免疫功能。CHB患者體內(nèi)誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞免疫耐受的機制目前還未完全闡明，陰性選擇、外周致敏，以及淋巴因子合成異常都可能導(dǎo)致宿主細(xì)胞的低反應(yīng)性， 同時CHB患者抗原呈遞細(xì)胞的功能缺陷也與感染免疫有關(guān)。探討這些因素的作用有助于發(fā)現(xiàn)新的靶點或免疫標(biāo)志物，有效控制病毒的持續(xù)感染[2]。HBV感染結(jié)局與宿主免疫狀態(tài)密切相關(guān)，而免疫狀態(tài)與抗原呈遞細(xì)胞(APCs)的抗原識別功能、淋巴細(xì)胞功能，以及共刺激分子的第2信號有關(guān)，B7是最重要的共刺激分子，包括B7-1(CD80)和B7-2(CD86),其通過與CD28結(jié)合，在誘導(dǎo)免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用?？扇苄怨泊碳し肿拥漠惓１磉_(dá)與HBV感染后炎性進(jìn)展中T細(xì)胞的活化密切相關(guān)[3]。本研究通過分析參與HBV感染免疫的調(diào)控分子(共刺激分子)的表達(dá)變化，研究移植者和普通HBV感染者狀態(tài)的區(qū)別，尋找更有意義和更有針對性的免疫新標(biāo)志物，為移植后乙型肝炎復(fù)發(fā)及HBV慢性持續(xù)感染提供新的診療靶點。

1 資料與方法

1.1一般資料 納入四川大學(xué)華西醫(yī)院HBV感染相關(guān)的終末期肝病患者81 例，于2005年4月至 2013年3月接受肝移植手術(shù)的患者，均使用鈣調(diào)磷酸酶抑制劑為主的免疫抑制方案(FK506+MMF)，術(shù)后3～6個月停用類固醇激素，患者均處于穩(wěn)定期，排除酒精性肝病、急性排斥或慢性排斥者。排除丙型肝炎、丁型肝炎，供者均為HBV陰性。移植后患者均采用肌肉內(nèi)注射低劑量丙種球蛋白(HBIG)，結(jié)合拉米夫定(LAM)100 mg/d防止HBV再次感染。術(shù)后追蹤16～96個月，HBsAg陽性或HBV-DNA >1×103copy/mL被認(rèn)為HBV感染復(fù)發(fā)。收集2016年3月至2017年3月該院就診的CHB患者40例，同時收集36例健康體檢者作為健康對照者。CHB患者為HBsAg和/或HBV-DNA陽性持續(xù)6個月，排除甲型肝炎、丙型肝炎、戊型肝炎患者，以及人類免疫缺陷病毒和梅毒感染者；排除肝硬化、肝細(xì)胞癌、自身免疫性疾病、原發(fā)性肝癌患者。 經(jīng)該院倫理委員會批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

1.2實驗方法 收集所有研究對象的空腹靜脈血，采用eBioscience公司酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒檢測血清 sCTLA- 4、 sCD28、 sCD80、sCD86、γ干擾素(IFN-γ)水平。HbsAg、抗-HBs、抗-HBc、HbeAg、 抗-Hbe、抗-HCV、抗-HDV、抗-HGV、抗-HIV 使用羅氏化學(xué)發(fā)光法檢測，病毒載量HBV-DNA 應(yīng)用羅氏熒光定量PCR法檢測。嚴(yán)格按廠家說明書進(jìn)行操作。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，使用Mann-Whitney秩和檢驗分析sCTLA-4、sCD28、sCD80、sCD86、IFN-γ在各組血清中的表達(dá)差異；應(yīng)用Spearman相關(guān)分析比較sCTLA-4、sCD28、sCD80、sCD86、IFN-γ水平與轉(zhuǎn)氨酶、HBeAg、HBV-DNA的相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1各類研究對象可溶性共刺激分子表達(dá)水平的結(jié)果比較 CHB患者sCTLA-4、sCD80、sCD86、IFN-γ表達(dá)水平顯著高于健康對照者(P<0.05)；肝移植后乙型肝炎復(fù)發(fā)者IFN-γ表達(dá)水平顯著低于未復(fù)發(fā)者(P<0.05)，其他指標(biāo)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；肝移植后乙型肝炎復(fù)發(fā)者sCTLA-4、sCD86和 IFN-γ表達(dá)水平顯著低于CHB患者(P<0.05)。見表1～3。

表1 CHB患者和健康對照者血清可溶性共刺激分子表達(dá)水平的結(jié)果比較[M(P25,P75),ng/mL]

注：與健康對照比較，*P<0.05

表2 肝移植后乙型肝炎復(fù)發(fā)者和未復(fù)發(fā)者血清可溶性共刺激分子表達(dá)水平的結(jié)果比較[M(P25,P75),ng/mL]

注：與未復(fù)發(fā)比較，*P<0.05

表3 乙型肝炎復(fù)發(fā)者和CHB患者血清可溶性共刺激分子表達(dá)水平的結(jié)果比較[M(P25,P75),ng/mL]

注：與CHB比較，*P<0.05

2.2可溶性共刺激因子和病毒復(fù)制及肝臟損傷的相關(guān)性 HBV感染者sCTLA-4水平與HBV-DNA顯著相關(guān)， sCD86水平與HBeAg定量結(jié)果顯著相關(guān)，sCD80水平與天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)顯著相關(guān)，IFN-γ水平與AST和谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)顯著相關(guān)。其他指標(biāo)之間無相關(guān)性。見表4。

表4 血清可溶性共刺激分子水平與肝功損傷及病毒復(fù)制的相關(guān)性(r)

注：ALT表示丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；ALP表示堿性磷酸酶；*P<0.05

3 討 論

HBV感染是威脅全球的健康問題，HBV病毒發(fā)生免疫逃逸導(dǎo)致宿主慢性持續(xù)感染的機制仍不清楚，HBV特異的CD4+Th和CD8+Th淋巴細(xì)胞在病毒清除過程中起重要作用[4-5]。Th1反應(yīng)不僅對細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)活化十分重要，而且對抗體生成也重要。由HBV導(dǎo)致的肝臟損傷是由于宿主相關(guān)免疫反應(yīng)功能不足，未能清除病毒感染細(xì)胞造成。針對HBV感染的抗體反應(yīng)通過與病毒顆粒結(jié)合形成免疫復(fù)合物而清除病毒，該特異細(xì)胞免疫反應(yīng)是造成病毒持續(xù)感染者肝細(xì)胞壞死的主要原因，該功能主要由活化的CTL細(xì)胞執(zhí)行。Th和Treg也參與免疫反應(yīng)過程。Th1型細(xì)胞因子可活化免疫應(yīng)答而抑制病毒復(fù)制，而Th2型細(xì)胞因子抑制免疫炎性反應(yīng)而有利于病毒的持續(xù)存在。病毒會刺激宿主環(huán)境的改變，有利于Treg的招募和活化，為自身存活創(chuàng)造有利條件[6-7]。

T細(xì)胞活化依賴抗原呈遞細(xì)胞APCs的作用，而活化信號的傳遞離不開共刺激因子的作用。T淋巴細(xì)胞的活化需要雙重信號刺激，HBV表面抗原(HBsAg)是胸腺依賴抗原，其產(chǎn)生免疫應(yīng)答必須依賴APC主要組織相容性復(fù)合體與T細(xì)胞受體(TCR)/CD3結(jié)合所產(chǎn)生的第1信號，以及由APC共刺激分子與T細(xì)胞相應(yīng)受體結(jié)合產(chǎn)生的第2信號共同作用[8]。B7分子是重要的共刺激分子，主要包括B7-1(CD80)和B7-2(CD86)，與其受體CD28作用，產(chǎn)生正性共刺激信號，促進(jìn)免疫活化及免疫應(yīng)答反應(yīng)，增強CD4+T細(xì)胞活性，促進(jìn)白細(xì)胞介素-2(IL-2)、IFN-γ產(chǎn)生，引起肝組織產(chǎn)生明顯的壞死性炎性反應(yīng)[9-10]。

T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4(CTLA-4)是免疫球蛋白超家族成員，結(jié)構(gòu)上與CD28同源。CTLA-4僅表達(dá)活化的Th細(xì)胞，是負(fù)性抑制性共刺激分子。CD80和CD86通過與CTLA-4結(jié)合而促進(jìn)Treg功能，對HBV特異性CTL免疫應(yīng)答起負(fù)性調(diào)控作用[11-12]?？扇苄问絪CTLA-4表達(dá)未刺激的T細(xì)胞，刺激后釋放至血漿。有研究證實，免疫反應(yīng)的早期階段sCTLA-4起著比膜mCTLA-4更為重要的作用，因為sCTLA-4可以在未刺激T細(xì)胞持續(xù)表達(dá)，而膜mCTLA-4只在T細(xì)胞活化時才表達(dá)，且體外試驗顯示sCTLA-4還具有免疫調(diào)節(jié)作用。CD80/CD86與CD28結(jié)合，提供正性共刺激信號，可使T細(xì)胞活化，產(chǎn)生IFN-γ，從而產(chǎn)生壞死性炎性損傷，CD80/CD86與CTLA-4配對作用，降低Th1反應(yīng)，活化CD8+T，減少殺傷性免疫反應(yīng)[13]。

本研究結(jié)果提示，CHB患者sCTLA-4、sCD80、sCD86、IFN-γ顯著高于健康對照者(P<0.05)，但肝移植后乙型肝炎復(fù)發(fā)者IFN-γ顯著低于未復(fù)發(fā)者(P<0.05)，sCTLA-4、sCD86水平與病毒復(fù)制相關(guān)，sCD80、IFN-γ水平與肝臟損傷相關(guān)?？赡苡捎趕CTLA-4升高并不能上調(diào)CTL，相反誘導(dǎo)了免疫耐受，病毒復(fù)制增加。2種HBV感染的可溶性因子表達(dá)水平的差異提示CTL功能存在差異，IFN-γ水平可以證實。IFN-γ是一種抗病毒的細(xì)胞因子，由HBV特異的CTL產(chǎn)生，CD8+T下調(diào)可導(dǎo)致IFN-γ減少。有研究表明，免疫反應(yīng)的早期階段sCTLA-4阻斷CD28/B7下調(diào)T細(xì)胞活化，而在免疫反應(yīng)過程中，sCTLA-4阻斷mCTLA-4/B7，上調(diào)T細(xì)胞活化[14]。本研究結(jié)果推測，HBV感染者存在Th17/Treg平衡紊亂，是由于mCTLA-4等負(fù)性調(diào)節(jié)分子增加，造成Th17減少和Treg增加，Treg誘導(dǎo)免疫耐受致使HBV感染持續(xù)。肝移植后復(fù)發(fā)者的sCTLA-4和sCD86降低造成mCTLA-4/CD86相互作用的增加，下調(diào)Th1反應(yīng)，活化CD8+T，減少殺傷反應(yīng)。上述2種情況的CD28信號均未起主要作用。免疫抑制劑的長期使用造成肝移植者免疫殺傷功能極大地減弱，共刺激分子介導(dǎo)的信號通路無法正常調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，表現(xiàn)為多種因子較CHB患者降低。由于本研究移植后乙型肝炎復(fù)發(fā)者和未復(fù)發(fā)者均接受鈣調(diào)磷酸酶抑制劑和丙種球蛋白預(yù)防性治療，因此這些因素是同時影響，結(jié)果具有一定的臨床意義。

綜合上述，HBV感染存在免疫平衡向負(fù)性共刺激分子誘導(dǎo)免疫耐受的方向偏倚，而肝移植患者由于使用免疫抑制劑，細(xì)胞免疫功能狀態(tài)與CHB患者存在差異。如果能找到一些途徑阻斷負(fù)性共刺激通路活性，或許能為控制HBV感染提供新的防治靶點，同時，負(fù)性可溶性共刺激分子sCTLA-4、sCD80、sCD86、IFN-γ可作為反映CHB感染免疫狀態(tài)的標(biāo)志物，但移植后乙型肝炎復(fù)發(fā)者僅IFN-γ可作為反映感染免疫狀態(tài)的標(biāo)志物。