李龍，劉樂(lè)荷，伍建榕，，蔣勇，馮立，趙霞

(1. 西南地區(qū)生物多樣性保育國(guó)家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224； 2. 西南林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院 云南省高校森林災(zāi)害預(yù)警控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224； 3. 攀枝花市林業(yè)局森林病蟲(chóng)害防治檢疫站，四川 攀枝花 617202)

車(chē)桑子Dodonaeaviscosa為無(wú)患子科Sapindaceae車(chē)桑子屬植物，廣泛分布在熱帶、亞熱帶、暖溫帶，中國(guó)主要分布在華南和西南地區(qū)。在云南金沙江干熱河谷中部?jī)砂?、福建南部、臺(tái)灣、廣東、廣西、海南、四川均有分布。車(chē)桑子是西南干熱河谷地區(qū)重要的本土樹(shù)種，對(duì)該地區(qū)植被恢復(fù)、水土保持、土壤有機(jī)碳含量提高具有重要作用[1]。

植原體phytoplasma原稱(chēng)類(lèi)菌原體(MLO)，是一類(lèi)無(wú)細(xì)胞壁，存在于植物篩管細(xì)胞、介體昆蟲(chóng)各個(gè)組織中的類(lèi)似植物病原細(xì)菌，不能單獨(dú)培養(yǎng)的原核生物。植原體能引起許多林木、蔬菜、農(nóng)作物發(fā)病，給農(nóng)林生產(chǎn)造成重大損失，最近幾年發(fā)現(xiàn)比較多，并且有不斷增加的趨勢(shì)[2]。由植原體引起的病害能讓寄主產(chǎn)生以下幾種癥狀：主枝和側(cè)枝生長(zhǎng)受到抑制，腋芽和不定芽大量生長(zhǎng)，從而形成叢枝、矮化癥狀；葉片褪綠黃化，葉變?。换ㄆ靼l(fā)生變態(tài)；果實(shí)變小、畸形或不結(jié)實(shí)。在調(diào)查攀枝花林木病蟲(chóng)害過(guò)程中發(fā)現(xiàn)車(chē)桑子叢枝病發(fā)生較為普遍，為了防止車(chē)桑子叢枝病發(fā)生面積的進(jìn)一步擴(kuò)大，也為了更好地防治此種病害，利用已建立的PCR技術(shù)對(duì)在攀枝花采集的車(chē)桑子叢枝病株進(jìn)行了植原體檢測(cè)，對(duì)擴(kuò)增得到的植原體16S rDNA片段進(jìn)行同源性比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析，并應(yīng)用林業(yè)有害生物風(fēng)險(xiǎn)分析指標(biāo)體系對(duì)車(chē)桑子叢枝病進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估分析。

1 材料和方法

1.1 病害調(diào)查 在攀枝花市米易縣10個(gè)車(chē)桑子種植區(qū)進(jìn)行叢枝病調(diào)查，在每一種植區(qū)選擇50 m×50 m樣方，在樣方內(nèi)隨機(jī)選擇30株車(chē)桑子調(diào)查，記錄叢枝車(chē)桑子的株數(shù)。

1.2 基因檢測(cè)材料 車(chē)桑子叢枝病植株和無(wú)癥植株于2015年6月采自四川省攀枝花市米易縣草壩子車(chē)桑子種植區(qū)。同時(shí)在云南省紅河州建水縣和元陽(yáng)縣采集無(wú)癥車(chē)桑子植株作為陰性對(duì)照，樣品均保存在-80 ℃冰箱。

1.3 車(chē)桑子叢枝病植原體的檢測(cè)

1.3.1 葉片總DNA提取 分別稱(chēng)取0.1 g叢枝病植株和無(wú)癥狀植株的幼嫩葉片，用植物基因組DNA提取試劑盒(OMEGA)(昆明碩陽(yáng)科技有限公司)提取車(chē)桑子葉片的總DNA，并將DNA置于-20 ℃冰箱中保存，備用。

1.3.2 引物及PCR反應(yīng)條件 利用植原體16S rDNA通用引物R16mF2 (5′-CATGCAAGTCGAACGGA-3′)/R16mRl(5′-CTTAACCCCAATCATCGAC-3′)[3]為常規(guī)PCR引物，目的條帶為1 500 bp，然后以通用引物對(duì)R16F2(5′- ACGACTGCTGCTAAGACTGG-3′)和R16R2(5′-TGACGGGCGGTGTGTACAAA-3′)[3]為巢式PCR擴(kuò)增引物，預(yù)期產(chǎn)物為1 200 bp。常規(guī)PCR總反應(yīng)體系為20 μL，其中，2×Power Tap PCR MasterMix(北京百泰克生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品)為10 μL，雙蒸水為7.8 μL，上下游引物各0.6 μL，DNA模板1 μL。PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min后，進(jìn)入以下循環(huán)：94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min 30 s，35個(gè)循環(huán)后在72 ℃條件下保持10 min，最后在PCR儀4 ℃條件下存放。待整個(gè)PCR反應(yīng)結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物5 μL在1%瓊脂糖凝膠中點(diǎn)樣，進(jìn)行電泳檢測(cè)，其余放在-20 ℃保存?zhèn)溆?。以常?guī)PCR產(chǎn)物為反應(yīng)模板，以 R16F2/R16R2為擴(kuò)增引物，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)，進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增(其余反應(yīng)條件同常規(guī)PCR)。最后分別取PCR產(chǎn)物5 μL在1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)。

1.4 核苷酸序列測(cè)定及分析 將含有目的片段的Nested-PCR產(chǎn)物送至昆明碩陽(yáng)科技有限公司測(cè)序，將測(cè)得的16S rDNA基因序列在NCBI中進(jìn)行BLAST分析。從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中分別下載來(lái)自不同組的植原體，利用MEGA7.0中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.5 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估分析 林業(yè)有害生物(不含有害植物)風(fēng)險(xiǎn)分析指標(biāo)體系[4-5]參照表1，風(fēng)險(xiǎn)分析指標(biāo)體系采用的量化計(jì)算公式見(jiàn)表2。

表1 林業(yè)有害生物(不含有害植物)風(fēng)險(xiǎn)分析指標(biāo)體系

續(xù)表

風(fēng)險(xiǎn)分析等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn) 風(fēng)險(xiǎn)綜合評(píng)價(jià)值(R)分為4級(jí)，2.50≤R<3.00代表特別危險(xiǎn)，2.00≤R<2.50代表高度危險(xiǎn)，1.50≤R<2.00代表中度危險(xiǎn)，0≤R<1.50代表低度危險(xiǎn)。

表2 風(fēng)險(xiǎn)分析指標(biāo)體系采用的量化計(jì)算公式

2 結(jié)果分析

2.1 車(chē)桑子在種植區(qū)的發(fā)病情況 車(chē)桑子叢枝病的癥狀表現(xiàn)為小葉、黃化、叢枝。感病植株的樹(shù)勢(shì)比正常植株弱，腋芽和不定芽大量生長(zhǎng)，形成叢枝、矮化癥狀(圖1)。

圖1 車(chē)桑子叢枝病株和健株癥狀比較

米易縣各車(chē)桑子種植區(qū)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，坊田鄉(xiāng)的車(chē)桑子感病率最高，達(dá)到53.4%，小麻柳坪的車(chē)桑子感病率最低，為16.7%(表3)。

表3 米易縣種植區(qū)車(chē)桑子感病率

2.2 PCR測(cè)序分析 分別以無(wú)癥和感病車(chē)桑子植株總DNA為模板，用R16mF2/R16mR2引物對(duì)進(jìn)行普通PCR，以及用R16F2/R16R2引物對(duì)進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，其中在攀枝花市米易縣采集的無(wú)癥和感病車(chē)桑子樣品中均獲得較亮的DNA片段，約1 200 bp，與Lee[3,6]等的結(jié)果相同，說(shuō)明此種病原為系統(tǒng)侵染，而且植株中含有植原體病原；在云南省紅河州元陽(yáng)縣和建水縣采集的無(wú)癥車(chē)桑子植株，并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)約1 200 bp的DNA片段，說(shuō)明了車(chē)桑子沒(méi)有被植原體侵染(圖2)。

注：M:2 000 bp Marker； 1-3.米易縣叢枝癥狀車(chē)桑子； 4-6.米易縣無(wú)癥車(chē)桑子； 7-8.建水縣無(wú)癥狀車(chē)桑子； 9-10.元陽(yáng)縣無(wú)癥車(chē)桑子。

圖2車(chē)桑子叢枝植原體16SrDNA巢式PCR擴(kuò)增

2.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建與同源分析 獲得的1條植原體DNA序列(登錄號(hào)：MG470796)與 GenBank中登錄的植原體各組中的代表性序列比較，并通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù))進(jìn)一步對(duì)比分析。車(chē)桑子叢枝病植原體與翠菊黃化病、柳葉菜屬叢枝病、藍(lán)莓叢枝病病原等16S rI-B組的各植原體株系在同一進(jìn)化枝上(圖3)。

圖3 用鄰接法構(gòu)建的車(chē)桑子叢枝病植原體16S rDNA系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.4 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估分析

2.4.1 有關(guān)分布 我國(guó)車(chē)桑子主要分布在云南金沙江干熱河谷中部?jī)砂?；除此之外，?guó)內(nèi)的福建南部、臺(tái)灣、廣東、廣西、海南、四川均有分布。而車(chē)桑子叢枝病主要分布在我國(guó)干熱河谷地區(qū)。

2.4.2 潛在危害性 引起車(chē)桑子叢枝病的病原為植原體。植原體寄主范圍廣，危害嚴(yán)重；受害植物近千種，在我國(guó)由植原體引起的泡桐叢枝病、棗瘋病、苦楝叢枝病、桑萎縮病、萵苣黃化病等是一類(lèi)毀滅性病害，長(zhǎng)期以來(lái)對(duì)我國(guó)經(jīng)濟(jì)作物和綠化樹(shù)種造成了巨大損失。

2.4.3 寄主植物的經(jīng)濟(jì)重要性 在我國(guó)干熱河谷地區(qū)，凡是車(chē)桑子生長(zhǎng)的地方均能發(fā)現(xiàn)車(chē)桑子叢枝病的存在。車(chē)桑子是我國(guó)干熱河谷地區(qū)植被恢復(fù)的重要樹(shù)種。車(chē)桑子叢枝病的蔓延將影響車(chē)桑子生長(zhǎng)和生態(tài)環(huán)境建設(shè)，從而威脅著我國(guó)干熱河谷地區(qū)的植被恢復(fù)。

2.4.4 傳播擴(kuò)散的可能性 車(chē)桑子叢枝病的傳播途徑主要有3種。一是木虱傳播。其靠飛行和借助風(fēng)力可以進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播。二是接穗傳播。嫁接換種或育苗時(shí)，無(wú)意間選取了病樹(shù)上的接穗引起叢枝病傳播蔓延。三是苗木傳播。苗木從疫區(qū)調(diào)進(jìn)。種植了帶病苗木引起傳播蔓延。

2.4.5 危險(xiǎn)性管理難度 抗生素防治車(chē)桑子叢枝病有一定效果，考慮到車(chē)桑子叢枝病的發(fā)生面積較大、侵染來(lái)源較多，且該病具有隱癥現(xiàn)象，該病難以在短時(shí)間內(nèi)得到控制。

2.4.6 評(píng)估分析 綜合分布情況、潛在危害性、寄主植物的重要性、傳播擴(kuò)散的可能性和危害性管理難度等幾個(gè)方面的描述，對(duì)車(chē)桑子叢枝病的各個(gè)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估指標(biāo)進(jìn)行賦分(表4)。

表4 車(chē)桑子叢枝病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估指標(biāo)及賦值

續(xù)表

根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)分析指標(biāo)體系采用的量化計(jì)算公式(表2)，對(duì)車(chē)桑子叢枝病進(jìn)行各項(xiàng)評(píng)判指標(biāo)和風(fēng)險(xiǎn)性R計(jì)算；其中分析區(qū)域內(nèi)分布情況P1=2.05；傳入、定殖和擴(kuò)散的可能性P2=2.277 2；潛在危害性P3=0.884；受害寄主經(jīng)濟(jì)重要性(受害對(duì)象的重要性)P4=2.0；危險(xiǎn)性管理難度P5=2.47；風(fēng)險(xiǎn)綜合評(píng)價(jià)值R=1.900 8，達(dá)到中度危險(xiǎn)級(jí)別。

3 結(jié)論與討論

利用植原體16S rDNA通用引物，對(duì)攀枝花市米易縣草壩子叢枝車(chē)桑子植株和健康車(chē)桑子植株進(jìn)行巢式PCR檢測(cè)，可擴(kuò)增出1.2 kb的特異條帶，在看似健康的車(chē)桑子葉片中都能檢測(cè)到植原體的存在，說(shuō)明車(chē)桑子叢枝病存在潛伏期。測(cè)序序列均與植原體有同源性關(guān)系，且與植原體的16S rI-B亞組同源性最高；對(duì)云南紅河州兩縣的車(chē)桑子健康植株進(jìn)行巢式PCR檢測(cè)，沒(méi)有擴(kuò)增出1.2 kb的特異條帶，反應(yīng)米易縣車(chē)桑子叢枝病的危害程度較高；通過(guò)對(duì)攀枝花米易縣車(chē)桑子叢枝病進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，其風(fēng)險(xiǎn)綜合評(píng)價(jià)值R=1.900 8，這種病害達(dá)到中度危險(xiǎn)級(jí)別。車(chē)桑子作為干熱河谷地區(qū)重要的固沙保土、植被恢復(fù)的重要樹(shù)種，車(chē)桑子叢枝病是危害車(chē)桑子的一種嚴(yán)重病害?；架?chē)桑子叢枝病的植株不能像其它作物一樣直接鏟除，因此相關(guān)部門(mén)應(yīng)該給予重視。為了控制這種病害蔓延，建議林業(yè)、農(nóng)業(yè)部門(mén)統(tǒng)一認(rèn)識(shí)，協(xié)同防治，確保防治效果，把疫區(qū)控制在最小范圍。從構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)觀察可知，檢測(cè)序列屬于16S rI-B亞組，并且與翠菊黃化病、苦楝叢枝病、白蠟樹(shù)叢枝病等16S rI-B組各植原體株系在同一進(jìn)化枝上。于少帥 等[7]通過(guò)多位點(diǎn)序列分析將不同地區(qū)的苦楝叢枝分為4個(gè)進(jìn)化類(lèi)群，而干熱河谷不同地區(qū)的車(chē)桑子叢枝是否也分為不同的類(lèi)群還需進(jìn)一步研究。本次只研究米易縣的車(chē)桑子叢枝病，干熱河谷地區(qū)的車(chē)桑子叢枝病是否存在明顯的地區(qū)專(zhuān)化型，是否存在不同地區(qū)的遺傳多樣性，要回答這些問(wèn)題還需通過(guò)擴(kuò)大樣品的檢測(cè)數(shù)量、測(cè)定核糖體蛋白(rp)基因、延伸因子(tuf)基因等較16S rDNA具有較大變異性的基因以獲得更多分子生物學(xué)信息來(lái)加以證實(shí)[8]。