侯曉杰，梁魁景，歐陽(yáng)汝欣，蘆站根

(衡水學(xué)院生命科學(xué)系，河北 衡水 053000)

近年來(lái)蘋(píng)果輪紋病的危害日趨嚴(yán)重，發(fā)生頻率大幅增加，嚴(yán)重影響了我國(guó)蘋(píng)果品質(zhì)和產(chǎn)量，使果農(nóng)遭受巨大經(jīng)濟(jì)損失。我國(guó)華北、華東、東北等地蘋(píng)果輪紋病發(fā)生嚴(yán)重，國(guó)光、富士、金冠、紅月等都是易感品種[1]。目前，植物內(nèi)生菌在病蟲(chóng)害生物防治方面已經(jīng)應(yīng)用，植物內(nèi)生真菌、細(xì)菌、放線(xiàn)菌防治植物病害效果顯著。例如，利用大豆根瘤內(nèi)生細(xì)菌防治棉花枯萎病[2]，桃樹(shù)根部?jī)?nèi)生細(xì)菌防治桃褐腐病[3]，劍麻內(nèi)生細(xì)菌JM-3防治蘋(píng)果腐爛病[4]，姜、蒜內(nèi)生菌防治蘋(píng)果輪紋病[5]等。

衡水湖的外來(lái)入侵植物黃頂菊Flaveriabidentis，根莖發(fā)達(dá)，適應(yīng)性強(qiáng)，具較強(qiáng)的化感作用。黃頂菊入侵性如此強(qiáng)大，在其體內(nèi)的內(nèi)生菌與它互利共生，所以肯定具有協(xié)同作用[6]。菌株本身或分泌物具有抑制其他植物生長(zhǎng)的化學(xué)物質(zhì)。本研究以衡水湖外來(lái)入侵植物黃頂菊為材料，研究其組織內(nèi)可培養(yǎng)內(nèi)生菌對(duì)于蘋(píng)果輪紋病病菌Botryosphaeriadothidea是否有拮抗作用[7]，期望找出能夠抑制蘋(píng)果輪紋病病菌生長(zhǎng)的菌株。

1 材料與方法

1.1 材料 黃頂菊，2015年10月6日采于衡水湖國(guó)家濕地公園，1 a生完整植株。蘋(píng)果輪紋病病菌，來(lái)源于衡水學(xué)院生命科學(xué)系園林植物學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生細(xì)菌的分離、純化 用自來(lái)水沖洗黃頂菊3 min，去除植株表面附著的泥沙，室內(nèi)晾干。分別取根、莖、葉、花各5 g，無(wú)菌水清洗干凈，置于75%酒精溶液中浸泡30 s，轉(zhuǎn)至3.125%次氯酸鈉溶液中浸泡6 min，無(wú)菌水清洗5次。將各部分組織分別剪碎放入研缽中，加入10 mL無(wú)菌水，充分研磨，靜置備用。分別吸取50，100，150 μL研磨液，涂抹于NA平板上，每組織重復(fù)3次，28 ℃培養(yǎng)2～3 d。待菌落長(zhǎng)出后，觀察記錄菌落形態(tài)、邊緣光滑度、大小、顏色，挑取單菌落劃線(xiàn)純化，4 ℃保存。

1.2.2 內(nèi)生細(xì)菌對(duì)蘋(píng)果輪紋病病菌的對(duì)峙培養(yǎng) 注入2 mL無(wú)菌水至純化的內(nèi)生菌培養(yǎng)皿內(nèi)，玻璃刮棒輕輕刮取平板上的細(xì)菌，用移液器吸取渾濁液轉(zhuǎn)至三角瓶，密封瓶口后震蕩1min使液體混合均勻。用722分光光度計(jì)調(diào)整細(xì)菌懸濁液濃度，使其波長(zhǎng)665 nm下的OD值為1.000，密封口備用。用直徑1 cm的打孔器在復(fù)壯后的蘋(píng)果輪紋病培養(yǎng)基上打孔，挑取菌餅倒扣接種在新的PDA平板上。以菌餅為中心，周?chē)鶆蚍胖?個(gè)直徑1 cm的圓形滅菌濾紙片，濾紙片中心距培養(yǎng)皿邊緣約1.5 cm，每濾紙片分別接種50 μL細(xì)菌懸濁液，每種細(xì)菌重復(fù)3次。對(duì)照為無(wú)菌水。PDA平板置于28 ℃恒溫培養(yǎng)4～5 d。

1.3 數(shù)據(jù)處理 用Excel軟件處理數(shù)據(jù)及作圖，用SPSS 17.0進(jìn)行方差分析，差異顯著性水平為5%(P<0.05)。

抑菌率(%)=(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/對(duì)照菌落直徑×100

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生細(xì)菌的分離 由于分離培養(yǎng)時(shí)吸取的100，150 μL研磨液的NA平板上菌落密度過(guò)大，無(wú)法辨別單個(gè)菌落的特征，所以只對(duì)50 μL研磨液平板上的菌株進(jìn)行篩選。通過(guò)觀察，黃頂菊植株內(nèi)共分離到14株菌株(表1)，其中根、莖、葉組織各分離到4株，花組織分離到2株。根、莖、葉器官的分離比率較高。

表1 黃頂菊組織可培養(yǎng)內(nèi)生菌的分離結(jié)果

2.2 對(duì)峙培養(yǎng) 除根3菌株外其余13株菌株都對(duì)蘋(píng)果輪紋病菌絲有抑制效果。菌株莖1、莖2、莖4、花1、花2抑菌效果與對(duì)照比較具有顯著性差異，但這5菌株之間抑制效果差異性不顯著。抑菌效果最好的莖4菌株，其真菌菌落直徑為(39.96±2.66) mm，抑菌率為33.21%(表2)。

表2 黃頂菊組織內(nèi)可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌對(duì)蘋(píng)果輪紋病病菌的菌絲生長(zhǎng)抑制結(jié)果

注:表中同列標(biāo)有不同字母表示組間差異顯著(P<0.05)。

3 結(jié)論與討論

黃頂菊植株各組織器官均能分離到可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌，且大部分菌株對(duì)蘋(píng)果輪紋病菌絲生長(zhǎng)具有抑制效果，其中莖、花組織內(nèi)生細(xì)菌的抑菌效果較好，抑菌率最高達(dá)33.21%，說(shuō)明黃頂菊內(nèi)生細(xì)菌是潛在的生防菌資源，可為進(jìn)一步篩選蘋(píng)果輪紋病的生防制劑奠定基礎(chǔ)。根3菌株的抑菌率為-1.34%，說(shuō)明該菌株對(duì)蘋(píng)果輪紋病菌絲生長(zhǎng)不但無(wú)效還起到了刺激其生長(zhǎng)的作用，后續(xù)實(shí)驗(yàn)有待驗(yàn)證。

目前，黃頂菊的研究主要集中在生理、生態(tài)、基礎(chǔ)防除及生物活性和化學(xué)成份等方面[8-11]，其生物成份和化學(xué)成份具有抗菌、殺蟲(chóng)活性[12]。本文對(duì)于黃頂菊內(nèi)生菌的研究將為外來(lái)入侵雜草研究提供新的方向。另外，黃頂菊組織內(nèi)不可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌是否存在，以及是否對(duì)蘋(píng)果輪紋病菌具有拮抗效果有待進(jìn)一步研究。

蘋(píng)果輪紋病已成為我國(guó)蘋(píng)果產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的重要制約因子之一。生物防治作為新時(shí)期病害防治的研究熱點(diǎn)，在蘋(píng)果輪紋病的防治上由于受到技術(shù)、經(jīng)濟(jì)等原因并未大規(guī)模投入生產(chǎn)。因此，黃頂菊內(nèi)生菌對(duì)蘋(píng)果輪紋病的拮抗篩選研究可成為篩選經(jīng)濟(jì)、高效生防制劑的一部分，具有廣闊的市場(chǎng)前景。