肖龍敏，劉雪峰，張玉洲，王巖，薛煜

(1. 西北農(nóng)林科技大學林學院，陜西 楊陵 712100； 2.東北林業(yè)大學林學院，黑龍江 哈爾濱 150040；3.黑龍江省黑河市遜克縣道干林場，黑龍江 黑河 164499)

蒙古櫟Quercusmongolica是營造防風林、水源涵養(yǎng)林及防火林的優(yōu)良樹種，是國家二級珍貴樹種，也是中國東北林區(qū)主要次生林樹種及城市園景樹和行道樹樹種。蒙古櫟常常會被松櫟柱銹菌CronartiumquercuumBerk Miyabe侵染，葉子萎黃、枯落，給東北養(yǎng)蠶業(yè)造成巨大損失，又可作為第二年初侵染源，加重松瘤銹病(Cronartiumquercuum)侵染[1-4]。

為了解不同地區(qū)感病蒙古櫟葉上真菌種群的組成和分布情況，找出各自優(yōu)勢種和建群種，為控制松櫟柱銹菌進一步擴散，開發(fā)和利用蒙古櫟資源提供依據(jù)。2014年作者在4個地區(qū)采集松櫟柱銹菌侵染的蒙古櫟葉片，分離、培養(yǎng)、鑒定其上的真菌種群，以期為進一步研究和篩選松櫟柱銹菌的拮抗真菌提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 2014年春、秋季分別在大興安嶺塔河林業(yè)局、密山市興凱湖采集松櫟柱銹菌侵染的蒙古櫟越冬和當年病葉，當年秋季在黑龍江省五大連池朝陽林場和內(nèi)蒙自治區(qū)扎賚特旗神山林場采集松櫟柱銹菌侵染的蒙古櫟當年病葉；所采材料分別放入紙袋，帶回實驗室置于冰箱4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 分離培養(yǎng) 將蒙古櫟病葉樣本切成2 cm×2 cm小塊，用漂白粉1∶14倍液消毒3 min左右，取出用無菌水漂洗3次，用鑷子挑取葉片分別接種到PDA(配方：土豆200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 000 mL)和玉米粉培養(yǎng)基(配方：玉米粉20 g，瓊脂17 g，水1 000 mL)上，每個培養(yǎng)皿內(nèi)放5塊材料；各設5個重復。將接種后的培養(yǎng)皿倒置放入25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期觀察菌落生長情況。

1.2.2 菌種鑒定 待菌落形成后，挑取培養(yǎng)基上培養(yǎng)的真菌，制成臨時玻片或永久玻片，在顯微鏡下觀察，記錄并統(tǒng)計各菌種出現(xiàn)的頻率(檢出率)、形態(tài)特征；并結(jié)合培養(yǎng)特性及菌落的特征，根據(jù)工具書和其它相關真菌分類學資料進行種類鑒定[5-6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 大興安嶺地區(qū)蒙古櫟病葉真菌菌群種類與分布 大興安嶺地區(qū)蒙古櫟病葉上共分離真菌12屬(種)，其中PDA培養(yǎng)基上分離11屬(種)，玉米粉培養(yǎng)基上分離9屬(種)。

在PDA培養(yǎng)基上，越冬病葉和當年病葉分離出的真菌存在差異，其中越冬葉上共分離出7屬(種)，檢出率最高的是鏈格孢，為36%，為該真菌群落的優(yōu)勢屬，其次為假絲酵母Candida和青霉屬Penicillium，分別為24%和12%；當年病葉上共分離出7屬(種)，檢出率最高的是粉紅單端孢Trichotheciumroseum和毛霉屬Mucor，同為20.0%，其次為木霉屬Trichoderma和鐮刀菌屬Fusarium，分別為16%和12%(表1)。

在玉米粉培養(yǎng)基上，越冬病葉和當年病葉分離出的真菌也存在差異。其中越冬病葉上分離出4屬(種)，檢出率最高的是枝孢屬Cladosporiun，為40%，其次是鏈格孢，為16%；當年病葉上共分離出6屬(種)，檢出率最高的是枝孢屬，為76%，其次是黑孢屬Nigrospora，為28%(表1)。說明環(huán)境情況、養(yǎng)分有可能會影響到真菌種群的生長發(fā)育。

表1 大興安嶺地區(qū)松櫟柱銹菌侵染蒙古櫟病葉上真菌群落分布情況

無論在PDA培養(yǎng)基還是玉米粉培養(yǎng)基上，鏈格孢都出現(xiàn)在越冬病葉上，說明該菌有可能是該生境真菌群落的后來者。在PDA培養(yǎng)基上無論越冬病葉還是當年病葉，均可以分離到粉紅單端孢、鐮刀菌和青霉，表明這3種真菌都是該群落中的相對固定成員(表1)。

2.2 興凱湖地區(qū)蒙古櫟病葉上真菌菌群種類與分布 興凱湖地區(qū)蒙古櫟當年病葉上共分離到真菌11屬(種)，其中PDA培養(yǎng)基上分離6屬(種)，玉米粉培養(yǎng)基上分離5屬(種)；蒙古櫟越冬病葉上共分離到真菌10屬(種)，其中PDA培養(yǎng)基上分離9屬(種)，玉米粉培養(yǎng)基上分離5屬(種)。

越冬病葉上的真菌在PDA培養(yǎng)基上生長良好，菌絲繁茂，共分離出9屬(種)，檢出率最高的是鏈格孢，為60%，其次為粉紅單端孢為44%；當年病葉上共分離出6屬(種)，檢出率最高的是青霉和毛霉屬，分別為68%和48%。當年病葉的真菌檢出率普遍較高，在12%～68%之間(表2)。這與當時的水分充沛，溫度適宜的環(huán)境條件有關。

在玉米粉培養(yǎng)基上，越冬病葉和當年病葉分離出的真菌均為5個屬(種)，但種類不同。其中越冬病葉上真菌檢出率最高的是枝孢屬，為52%，其次是色串孢，為40%；當年病葉上真菌檢出率最高的是枝孢屬為84%，其次是黑孢屬，檢出率為32%。鏈格孢雖然不是優(yōu)勢屬，但是該群落中的固定成員，無論是在不同培養(yǎng)基上，還是不同的生活環(huán)境中均以一定的頻率出現(xiàn)(表2)。

表2 興凱湖地區(qū)松櫟柱銹菌侵染蒙古櫟病葉上真菌群落的分布情況

2.3 內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古櫟病葉上真菌菌群種類與分布 在內(nèi)蒙古神山林場蒙古櫟當年生病葉上共分離出真菌8屬(種)，其中PDA培養(yǎng)基上共分離真菌6種，枝孢屬為優(yōu)勢屬，占68%，亞優(yōu)勢屬種為青霉屬、粉紅單端孢，均為20%。玉米粉培養(yǎng)基上共分離真菌5屬(種)，枝孢屬為優(yōu)勢屬，占60%，鏈格孢為亞優(yōu)勢屬，占32%，再其次為色串孢屬Torula(表3)。

所有真菌屬(種)在PDA培養(yǎng)基上都生長旺盛，而在玉米粉培養(yǎng)基上菌絲均稀疏，說明玉米粉培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分不適于這些真菌生長。

表3 內(nèi)蒙古地區(qū)松櫟柱銹菌侵染蒙古櫟當年病葉上真菌群落分布情況

續(xù)表

2.4 五大連池地區(qū)蒙古櫟病葉上真菌菌群種類與分布 該地區(qū)共從蒙古櫟當年病葉上分離到真菌6屬(種)，其中PDA培養(yǎng)基上分離5屬(種)，檢出率最高的是粉紅單端孢，為64%，其次為芽枝霉和青霉，分別為48%和20%，鏈格孢和附球孢均為12%；在玉米粉培養(yǎng)基上分離5屬(種)，檢出率最高的是粉紅單端孢，為68%，其次是色串孢和枝孢屬，分別為56%和44%(表4)。五大連池地區(qū)當年生病櫟葉真菌種群數(shù)量較前3個地區(qū)低，這可能與當?shù)氐男…h(huán)境有關；五大連池屬近代活火山口，植被種類不十分豐富及環(huán)境條件干燥。

同樣，生長在玉米粉培養(yǎng)基上的真菌長勢羸弱，而生長在PDA培養(yǎng)基上的真菌長勢旺盛。

表4 五大連池地區(qū)松櫟柱銹菌侵染蒙古櫟病葉上真菌群落分布情況

3 結(jié)論與討論

松櫟柱銹菌是一種轉(zhuǎn)主寄生菌，性孢子、春孢子階段生長在樟子松Pinussylvestrisvar.mongolica上，夏孢子、冬孢子階段生長在蒙古櫟葉片上。作者通過對4個地區(qū)蒙古櫟病葉上真菌群落分布情況的研究，共分離得到18屬(種)真菌。發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)的越冬病葉和當年生病葉上，真菌種群分布均有所不同，優(yōu)勢種也不同。這可能與當?shù)丨h(huán)境以及病原菌自身特性有關。薛煜 等[4]通過對松櫟柱銹菌冬孢子萌發(fā)的研究發(fā)現(xiàn)，在松瘤銹病侵染循環(huán)中，冬孢子的侵染起著非常重要的作用。因冬孢子的壽命長，萌發(fā)力可持續(xù)3個月左右，冬孢子在適宜的環(huán)境條件下幾乎全部萌發(fā)，萌發(fā)力高于銹孢子的60%，冬孢子萌發(fā)產(chǎn)生的擔孢子還以產(chǎn)生次生擔孢子的形式來適應不利的萌發(fā)環(huán)境。薛煜 等[7]研究表明，蒙古櫟展葉時，正是松櫟柱銹菌成熟時，為了保護自身的安全，增強防御病原菌和其他生物的侵襲，而產(chǎn)生大量乙烯，但也可能正是其發(fā)散出的大量乙烯，又給松櫟柱銹菌傳導了有新“獵物”的信息，從而促進春孢子器成熟。Cristeseu 等[8]已證實植物受到病原微生物侵染后會在體內(nèi)積累大量乙烯，這說明寄主和病原菌之間是有化學感應的。

蒙古櫟病葉在不同培養(yǎng)基上培養(yǎng)分離的真菌種類不同，優(yōu)勢種也存在區(qū)別。4個地區(qū)在PDA培養(yǎng)基上分離的真菌種群均比玉米粉培養(yǎng)基上多，這與真菌各屬(種)生活所需營養(yǎng)條件和適宜的環(huán)境條件有關。大興安嶺地區(qū)，無論在PDA培養(yǎng)基還是玉米粉培養(yǎng)基上，在越冬病葉上都出現(xiàn)鏈格孢菌，說明該菌在該生境中不是真菌群落的早期成員，而是后期的葉片分解者。胡勤星 等[9]利用不同的碳源培養(yǎng)基培養(yǎng)鏈格孢屬真菌的7個種，表明7種鏈格孢菌的培養(yǎng)特征存在差異。許美玲 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，同一菌株在人工培養(yǎng)條件下的生態(tài)特性與外界環(huán)境條件下不完全相同，不論是溫度、pH值還是營養(yǎng)條件，在自然條件下其生長范圍更廣。于娟 等[11]對小興安嶺土壤表層真菌群落季節(jié)動態(tài)研究發(fā)現(xiàn)，土壤真菌的數(shù)量和種類受很多環(huán)境因素的影響，而林地內(nèi)的溫度、植被、土壤環(huán)境等因素都會隨著季節(jié)的變化而變化。

從黑龍江省和內(nèi)蒙古自治區(qū)4個地區(qū)蒙古櫟病葉上分離培養(yǎng)得到的真菌中，粉紅單端孢出現(xiàn)的頻率很高。粉紅單端孢是全球分布的一種真菌，以腐生為主，兼具寄生。1809年Link于德國柏林首次發(fā)現(xiàn)該菌，是引起多種植物病害的重要病原真菌，同時也具有較大的生物防治潛力。營金鳳 等[12]用粉紅單端孢菌株濾液對玉米小斑病(HelminthosporiummaydisNisik & Miy)孢子萌發(fā)作抑制試驗，結(jié)果表明，粉紅單端孢TrC菌株濾液對玉米小斑病菌孢子萌發(fā)有明顯抑制作用，處理2，4，8，12，24 h后，孢子萌發(fā)抑制率分別為37.5%，53.33%，66.15%，55.56%，0.65%；其中以處理后8 h的孢子萌發(fā)抑制率最高。另外，觀察發(fā)現(xiàn)，處理組萌發(fā)的孢子芽管較短，增粗、畸形。張世宏 等[13]培養(yǎng)粉紅單端孢誘導產(chǎn)生大量的孢外幾丁質(zhì)酶，抗菌活性試驗表明此純酶有抑制煙草赤星病菌Alternariaalternata、串珠鐮刀菌Fusariummoniliforme，稻瘟病菌Magnaporthegrisea，棉花黃萎菌Verticilliumdahliae，輪紋病菌Macrophomaspp.等病原菌孢子萌發(fā)和芽管伸長的作用，其中對棉花黃萎菌的抑制作用最強。此外，粉紅單端孢菌的弱寄生和土壤習居特點決定了該菌還可以分解土壤中的有機物質(zhì)，對于多種土傳和種傳植物病原菌有拮抗作用，所以粉紅單端孢又是一種重要的生防資源[14-17]。Urbasch[14,18]發(fā)現(xiàn)粉紅單端孢菌可以產(chǎn)生一種熱穩(wěn)定的細胞代謝產(chǎn)物，具毒素作用，可以對寄主真菌的菌絲生長和孢子萌發(fā)產(chǎn)生強烈抑制作用?？傊?，粉紅單端孢菌是一種重要的生防菌，可以在多種病原上寄生，抑制病原菌的擴展和危害，甚至殺死病原菌。