劉志廣 劉 芬 韓江紅

(新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院胸瘤一科，河南 新鄉(xiāng) 453000)

EffectsofsiRNAinterferenceonROBO1geneexpressiononcellcycle,proliferationandrelatedproteinsinesophagealcarcinoma

LIUZhi-Guang,LIUFen,HANJiang-Hong.

No.1DepartmentofChestTumor,XinxiangCentralHospital,Xinxiang453000,Henan,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of siRNA targeting interference roundabout, axon guidance receptor, homoloh 1(ROBO1) gene expression on proliferation and cell cycle of esophageal cancer EC109 cells and its possible mechanism.MethodsEsophageal cancer EC109 cells were randomly divided into blank group, control group and SiRNA-ROBO1 group. Negative siRNA and siRNA-ROBO1 were transfected into EC109 cells by liposome. The expression of ROBO1, nuclear related antigen Ki-67(Ki-67), proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and CyclinD1 protein were detected by Western blot. The proliferation activity of the cells was detected by CCK-8 assay and the cell cycle changes of EC109 were detected by flow cytometry.ResultsAfter interfering with ROBO1 expression, the expression of ROBO1 protein in EC109 cells was significantly lower than that in the blank group(P<0.05), and the cell proliferation activity was significantly decreased(P<0.05). The cells in G0/G1 phase were significantly increased(P<0.05), and in G2/M phase were significantly decreased(P<0.05). The expression levels of Ki-67, PCNA and CyclinD1 in siRNA-ROBO1 group were significantly lower than those in the blank group(P<0.05).ConclusionsROBO1 may inhibit the proliferation of esophageal cancer cells by affecting the proliferation and cycle-associated protein levels of esophageal cancer cells and arresting the cell cycle in G0/G1 phase.

【Keywords】 Esophageal cancer; siRNA; ROBO1; EC109

目前，國內(nèi)外對于食管癌的早期診斷和治療并未尋找到有效的方法，其五年生存率仍較低〔1〕。食管癌對人類的健康產(chǎn)生極大的危害，目前的治療手段是手術(shù)、放療、化療單獨或者聯(lián)合使用，但副作用較大，花費高，患者的預(yù)后較差，無法從根本上阻礙腫瘤的生長，因此需要我們不斷探索、尋找新的治療手段〔2〕。隨著科學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，促進人類對基因領(lǐng)域的相關(guān)研究，使人們可從基因水平闡釋腫瘤的發(fā)病機制。基因的變異、突變、表達量的變化等對腫瘤的演進均發(fā)揮重要作用〔3～5〕。目前，食管癌的發(fā)病機制尚不完全清楚，所以研究食管癌的發(fā)生、發(fā)展作用機制具有重大意義，探索新的診斷標(biāo)志物以及治療的靶基因，為降低食管癌的死亡率以及發(fā)病率提供實驗基礎(chǔ)。本文通過小RNA干擾技術(shù)(siRNA)干擾食管癌EC109細胞中軸突導(dǎo)向受體蛋白(ROBO)1表達，研究對EC109細胞增殖、周期及相關(guān)蛋白的影響，探索ROBO1在食管癌發(fā)生發(fā)展的作用及相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1實驗材料 人食管癌細胞系EC109購自美國Allcells公司，RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司，胎牛血清、青-鏈霉素、Opti-MEM購自美國Gibco公司，胰蛋白酶購自青島捷世康生物科技有限公司，LipofectamineTM2000試劑購自美國Invitrogen公司，siRNA、細胞增殖檢測試劑盒購自廣州銳博公司，細胞周期檢測試劑盒購自南京凱基生物科技有限公司，細胞周期蛋白(Cyclin)D1兔抗人單克隆抗體購自美國CST公司，細胞核相關(guān)抗原Ki-67(Ki-67)單克隆抗體、增殖細胞核抗原(PCNA)單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，β-actin單克隆抗體購自英國Abcam公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗購自北京鼎國生物公司。細胞恒溫培養(yǎng)箱購自德國Heraeus公司，酶標(biāo)儀購自美國BIO-RAD公司，臺式低溫高速離心機購自德國Eppendorf公司，流式細胞儀購自美國BD公司。

1.2細胞的培養(yǎng) 將人食管癌細胞EC109培養(yǎng)基于含10%胎牛血清、1% 100 U/ml青-鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于含有5%CO2的37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長濃度覆蓋培養(yǎng)瓶底約80%時，加入胰酶，顯微鏡中觀察自爆形態(tài)逐漸變?yōu)闄E圓，加入新鮮RPMI1640培養(yǎng)基終止消化，1 000 r/min離心5 min，以1∶3或1∶4的比例制成單細胞懸液，37℃常規(guī)繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3細胞的轉(zhuǎn)染 選擇對數(shù)期食管癌細胞，轉(zhuǎn)染前24 h常規(guī)消化細胞，加入無胎牛血清和雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基，將細胞密度調(diào)整為1×105個/孔，加入24孔板中，待細胞密度至50%～70%時，將細胞分為空白組、對照組(轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA)、siRNA-ROBO1組。吸取50 μl Opti-MEM稀釋脂質(zhì)體LipofectamineTM2000(2 μl/孔)，室溫靜置5 min；采用無RNA酶水將siRNA-ROBO1稀釋為2 μmol/L；將稀釋的脂質(zhì)體與siRNA-ROBO1混合均勻，室溫靜置20 min，形成脂質(zhì)體-siRNA-ROBO1轉(zhuǎn)染復(fù)合物；吸取10 μl轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入各孔細胞中，前后搖動混勻，置于37℃下繼續(xù)培養(yǎng)6 h，更換為含10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，Western印跡測定轉(zhuǎn)染效果。

1.4細胞增殖活力的檢測 將食管癌細胞接種至6孔板中，待細胞密度至50%～70%時，將細胞分為空白組、對照組、siRNA-ROBO1組，轉(zhuǎn)染細胞，方法同1.3；吸取100 μl細胞懸浮液加入96孔板中，使每孔細胞密度為(1～3)×103個，每組3個復(fù)孔，常規(guī)培養(yǎng)48 h，每孔加入10% CCK-8溶液，振蕩混勻，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1.5 h，測定細胞在450 nm波長下的吸光值(OD450 nm值)。

1.5細胞周期檢測 胰酶消化轉(zhuǎn)染后48 h的食管癌細胞，加入1 ml預(yù)冷的乙醇，4℃固定過夜，棄去乙醇，PBS液洗滌，加入200 μl 1 g/L RNaseA，室溫孵育30 min，吸取500 μl PI溶液，4℃避光孵育30 min，置于流式細胞儀中檢測。

1.6Western印跡檢測細胞中Ki-67、PCNA、CyclinD1蛋白的表達水平 胰酶消化轉(zhuǎn)染后48 h食管癌細胞，收集細胞，加入細胞裂解液，充分振蕩，冰上裂解15 min，12 000 r/min離心10 min，吸取上層，根據(jù)BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度。

清洗玻璃板、梳子、電泳裝置，晾干，配置10 ml 10%分離膠和5 ml 5%濃縮膠。將分離膠緩慢注入玻璃板，加至玻璃板上邊沿約3 cm，加入3 ml異丙醇覆蓋分離膠，室溫放置40 min，棄掉異丙醇，在分離膠上邊沿0.5 cm處緩慢注入濃縮膠，插入梳子，防止氣泡的出現(xiàn)。取30 μg蛋白樣品溶于等體積5×上樣緩沖液，100℃變性5 min。80 V電泳至溴酚藍進入分離膠，調(diào)整電壓至110 V，繼續(xù)電泳至溴酚藍到達凝膠邊緣。根據(jù)目的蛋白分子量的大小切下分離膠，組裝轉(zhuǎn)膜裝置，90 V，280 mA冰水中電泳60 min。Tris-Hcl緩沖鹽溶液+Tween(TBST)清洗轉(zhuǎn)膜后的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，加入含封閉液的平皿中，搖動封閉2 h，加入稀釋的一抗，搖床上孵育1.5 h，4℃過夜，TBST洗膜3次×10 min，加入二抗，搖床上孵育1.5 h，TBST洗膜3次×10 min，滴加化學(xué)發(fā)光試劑A液、B液，避光孵育3 min，暗室中曝光，成像儀中成像。

1.7統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件資料進行單因素方差分析及t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1Western印跡測定轉(zhuǎn)染效果 siRNA-ROBO1組ROBO1蛋白表達量(0.249±0.036)較空白組顯著降低(P<0.05)，對照組細胞中ROBO1蛋白水平(0.795±0.078)與空白組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖1，表1。

圖1 EC109細胞轉(zhuǎn)染后ROBO1蛋白的表達量

2.2ROBO1表達量降低對食管癌細胞增殖活力的影響 siRNA-ROBO1組細胞的增殖活力(0.302±0.045)較空白組(0.758±0.073)顯著降低(P<0.05)，對照組細胞的增殖活力(0.726±0.084)與空白組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.3ROBO1表達量降低對食管癌細胞細胞周期的影響 siRNA-ROBO1組G0/G1期細胞較空白組顯著增加(P<0.05)，G2/M期細胞顯著降低(P<0.05)，S期細胞變化不明顯，對照組細胞周期與空白組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

2.4ROBO1表達量降低對食管癌細胞中相關(guān)蛋白水平的影響 siRNA-ROBO1組PCNA、Ki-67、CyclinD1蛋白表達量較空白組顯著降低(P<0.05)，對照組細胞中PCNA、Ki-67、CyclinD1蛋白水平與空白組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖2，表2。

表1 ROBO1表達量降低對食管癌細胞細胞周期的影響

與空白組比較：1)P<0.05，下表同

圖2 ROBO1表達量降低對食管癌細胞中PCNA、Ki-67、CyclinD1蛋白水平的影響

組別PCNA/β-actinKi-67/β-actinCyclinD1/β-actin空白組0.628±0.0560.466±0.0450.458±0.042對照組0.619±0.0620.429±0.0630.469±0.053siRNA-ROBO1組0.230±0.0251)0.185±0.0211)0.158±0.0241)F值61.10632.60354.431P值0.0000.0010.000

3 討 論

ROBO1屬于免疫球蛋白超家族，是SLIT家族成員的跨膜受體，主要在神經(jīng)系統(tǒng)中分泌，對軸突導(dǎo)向發(fā)揮重要作用〔6～9〕。近年研究表明，ROBO1與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。研究證實，ROBO1在肝癌組織中的表達量上調(diào)，促進肝癌細胞增殖，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞新血管形成〔10〕。在自發(fā)腸腺瘤或SLIT2轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，ROBO1在腸道腫瘤組織中高表達，且可通過調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)因子的表達激活Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)信號通路，從而促進腫瘤的發(fā)生〔11〕。但是，在不同中的腫瘤組織中ROBO1發(fā)揮不同的作用。ROBO1在前列腺癌中通過與相應(yīng)的細胞因子結(jié)合間接激活鈣黏蛋白E和β-catenin信號通路促進前列腺癌細胞遷移〔12〕。在膽管癌中，通過免疫組化檢測膽管癌組織中ROBO1的表達量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ROBO1的表達水平與膽管癌患者的預(yù)后顯著相關(guān)，且ROBO1能阻礙膽管癌細胞的轉(zhuǎn)移能力〔13〕。研究發(fā)現(xiàn)，ROBO1在食管癌中異常表達，在食管癌的發(fā)生、發(fā)展的過程中發(fā)揮作用〔14〕。

本實驗表明轉(zhuǎn)染siRNA-ROBO1的食管癌細胞中ROBO1蛋白的表達量明顯降低，使細胞阻滯在G0/G1期發(fā)揮抑制食管癌細胞增殖的的作用。

Ki67、PCNA與腫瘤細胞的增殖密切相關(guān)。研究表明，Ki67在胃癌、肝癌及肺癌等惡性腫瘤中均高表達，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程以及組織轉(zhuǎn)移、浸潤、預(yù)后發(fā)揮重要作用〔15～17〕。Ki67的表達量對于腫瘤細胞的增殖、有絲分裂、周期具有重要作用，可作為腫瘤細胞的生物學(xué)特性及預(yù)后的評價指標(biāo)〔18〕。既往研究認為，PCNA參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，在結(jié)腸癌、口腔癌、肺癌、乳腺癌等多種腫瘤組織中高表達〔19～22〕。PCNA是DNA復(fù)制過程中的關(guān)鍵因子，能與細胞內(nèi)多種因子結(jié)合，調(diào)控細胞周期、DNA甲基化、DNA的損傷修復(fù)過程發(fā)揮多種功能。研究表明，PCNA與細胞的增殖、凋亡過程密切相關(guān)，其表達量可作為評價腫瘤惡性程度和細胞的增殖能力的指標(biāo)之一〔23〕。CyclinD1是細胞周期G1/S轉(zhuǎn)換過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在多種腫瘤中的表達量上調(diào)，其與惡性腫瘤的程度密切相關(guān)〔24〕。本實驗結(jié)果顯示，ROBO1表達量下降抑制細胞中Ki67、PCNA、CyclinD1蛋白的表達量。因此，推測抑制ROBO1表達可能通過影響細胞增殖相關(guān)因子Ki67、PCNA以及細胞周期相關(guān)因子CyclinD1的表達降低細胞的增殖能力。綜上所述，本實驗通過體外實驗抑制食管癌細胞中ROBO1表達，發(fā)現(xiàn)，食管癌細胞的增殖活性下降，細胞周期阻滯在G0/G1期，表明ROBO1與促進細胞增殖和調(diào)控細胞周期有一定關(guān)系，提示ROBO1基因在食管癌細胞中具有一定的致瘤性，其作用可能與Ki67、PCNA、CyclinD1的表達量有關(guān)。下一步將繼續(xù)在動物模型中研究ROBO1基因在食管癌中的作用，為探究食管癌的發(fā)病機制、靶向基因治療提供實驗依據(jù)。