邵明辰，王友令

（1.山東魯南牧工商有限公司，山東 滕州 277500；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，山東 濟(jì)南 250100）

禽流感(AI)由A型禽流感病毒引發(fā)的高度接觸性傳染病，它不但能造成養(yǎng)禽業(yè)的巨大經(jīng)濟(jì)損失，還對人類公共衛(wèi)生安全構(gòu)成威脅[1]。禽類感染禽流感病毒(Avian Influenza Virus，AIV)后，癥狀可表現(xiàn)為非顯性感染、亞臨診感染，或輕度呼吸道疾病，產(chǎn)蛋量下降直至急性全身致死性疾病等多種形式。禽流感病毒屬于正粘病毒科、流感病毒屬的A型流感病毒，為分節(jié)段的、單股、負(fù)鏈 RNA病毒，每個(gè)RNA片段都是由核蛋白包被形成RNPs復(fù)合體，RNPs是由基質(zhì)蛋白(M)構(gòu)成完整的膜包裹[2]。雖然家禽感染低致病性AIV的發(fā)病率、死亡率低，但可引起產(chǎn)蛋量下降，造成免疫抑制，造成養(yǎng)禽業(yè)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

H9N2禽流感病毒呈世界性分布，其按地區(qū)可分為北美和歐亞兩個(gè)種系[3]。我國于1994年首次公開報(bào)道，但未波及全國[4]。HA基因是A型流感病毒致病性的主要影響因子,主要通過HA識別宿主細(xì)胞的特異性受體，從而吸附于細(xì)胞表面，以吞噬小體的形式進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，膜融合后釋放病毒的RNP[5]。HA蛋白識別受體結(jié)合位點(diǎn)是感染的第一步，也是比較關(guān)鍵的一步。HA蛋白能識別兩種類型的受體，分別為α-2，3-半乳糖和α-2，6-半乳糖連接的唾液酸[6]。

為了解2016年山東地區(qū)H9N2亞型禽流感病毒HA基因的變異情況及探討其是否發(fā)生了重組，特選取所分離的10個(gè)H9N2亞型禽流感病毒分離株，對其HA基因進(jìn)行測序，分析其遺傳演化規(guī)律，為山東地區(qū)H9N2禽流感的防控提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 毒株 10株H9N2亞型禽流感病毒流行株由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所按照參考文獻(xiàn)中的方法進(jìn)行分離、鑒定及純化[1]。其毒株代表號依次為 A-CK-SD-XT31-2016-H9N2、A-CK-SD-XT33-2016-H9N2、A-CK-SD-XT34-2016-H9N2、A-CKSD-XT35-2016-H9N2、A-CK-SD-XT39-2016-H9N2、A-CK-SD-XT43-2016-H9N2、A-CK-SDXT44-2016-H9N2、A-CK-SD-XT46-2016-H9N2、ACK-SD-MHS3-2016-H9N2、A-CK-SD-MHS5-2016-H9N2。

1.2 主要試劑 SPF雞和雞胚均由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所SPF雞研究中心提供。Trizol、DNA回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、pMD18-T Vector、限制性內(nèi)切酶和一步法RT-PCR試劑盒均購自大連寶生物有限公司。

1.3 引物合成 參考GenBank上已發(fā)表的H9N2亞型禽流感病毒HA基因序列，利用Oligo6.0軟件設(shè)計(jì)了一對引物，由上海生工生物工程有限公司合成，用于擴(kuò)增HA基因全長序列。

H9上游引物(H9F)∶

5＇-CACCATGGAAACAATATATCACTAMT-3＇；

H9下游引物(H9R)∶

5＇-CTATATACAAATGTTGCRYCT-3＇。

引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。預(yù)期擴(kuò)增的HA基因大小為1687bp，編碼560個(gè)氨基酸。

1.4 擴(kuò)增 病毒RNA的提取及HA基因的RTPCR擴(kuò)增按照Trizol試劑盒說明書提取病毒RNA，取適量DEPC處理的超純水溶解RNA。RTPCR采用大連寶生物工程有限公司的一步法提取試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.5 PCR產(chǎn)物的克隆與序列分析 將PCR產(chǎn)物克隆測序，拼接所得HA基因序列，并結(jié)合GenBank上已發(fā)表的8株H9N2禽流感病毒株的HA基因序列（毒株具體信息及登錄號詳見表1），用MEGA5.0分別對其進(jìn)行遺傳演化分析，繪制系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹，從而對上述毒株的HA、NA基因分子遺傳變異情況進(jìn)行分析。

表1 下載毒株的基本信息及登錄號

2 結(jié)果與分析

2.1 HA基因遺傳分析 用 MEGA5.0對參考序列和本實(shí)驗(yàn)所得10個(gè)H9N2病毒分離株HA基因進(jìn)行遺傳演化分析，得到的進(jìn)化樹見圖1。

10株H9N2亞型AIV的HA基因的cDNA全序列，全長1742bp，ORF全長為1683個(gè)核苷酸，位置為34～1716位核苷酸，編碼560個(gè)氨基酸。將10個(gè)分離株與GenBank上發(fā)表的參考毒株進(jìn)行核苷酸序列和氨基酸序列的同源性比較，10個(gè)分離株與BJ94參考毒株HA基因的核苷酸之間的同源性為89.1%～91.3%，氨基酸之間的同源性為90.0%～93.4%；與 A/chicken/Zhejiang/HJ/2007（G57分支）參考毒株HA基因的核苷酸之間的同源性為89.1%～91.3%，氨基酸之間的同源性為93.6%～97.0%；而分離株之間的HA基因核苷酸同源性為94.1%～99.8%，氨基酸序列之間的同源性為94.3%～100%。

所有分離株的HA裂解位點(diǎn)均為RSSR↓GLF，有 6～8個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)（N-X-T/S，X 為除 P外的氨基酸），XT39毒株在 218～220位和313～315位出現(xiàn)糖基化位點(diǎn)雙缺失，XT205和XT208毒株在218～220位糖基化位點(diǎn)缺失，XT33和MHS3毒株在551～553位潛在糖基化位點(diǎn)缺失。10株分離株構(gòu)成HA唾液酸受體結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸在191位非常保守，為N（天冬酰胺），與經(jīng)典的禽流感國內(nèi)分離株一致。10株分離株中有3株在198位上變異為A （丙氨酸），6株變異為T（蘇氨酸），1株變異為M（甲硫氨酸）三種形式。10株分離毒在234位受體結(jié)合位點(diǎn)均為L（亮氨酸），具有與哺乳動物唾液酸a，2-6受體結(jié)合的特征，該類毒株的流行在公共衛(wèi)生上應(yīng)值得重視。從進(jìn)化樹分析可知，10個(gè)分離株同屬于歐亞分支中的A/Chicken/Beijing/1/1994(A/Duck/Hong-Kong/Y280/97)亞群，與近年在中國的雞群中流行的由A/chicken/Zhejiang/HJ/2007為代表的新的基因型(G57分支)遺傳關(guān)系最近[7]，推測是由其進(jìn)化演變而來。

圖1 10個(gè)H9N2病毒分離株HA基因進(jìn)行遺傳演化分析進(jìn)化樹

3 討論

HA基因是A型流感病毒致病性的主要影響因子。HA裂解位點(diǎn)氨基酸序列是決定禽流感病毒致病性和毒力強(qiáng)弱的關(guān)鍵因素之一。HA蛋白識別受體結(jié)合位點(diǎn)是感染的第一步，也是比較關(guān)鍵的一步。本研究中10個(gè)毒株HA基因裂解位點(diǎn)氨基酸序列為RSSR↓GLF，不存在多個(gè)連續(xù)堿性氨基酸插入，具有低致病性病毒分子特征。Steinhauer[8]發(fā)現(xiàn)流感病毒表面血凝素HA蛋白上第183、190和226位氨基酸是關(guān)鍵的受體結(jié)合位點(diǎn)，與病毒的受體結(jié)合特性和宿主特性相關(guān)。本研究中10個(gè)毒株HA受體結(jié)合位點(diǎn)的第149、198、234位氨基酸也存在變異。10個(gè)毒株有6～8個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)，10株分離株構(gòu)成HA唾液酸受體結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸在191位非常保守，為N（天冬酰胺），與經(jīng)典的禽流感國內(nèi)分離株一致。10株分離株中有3株在198位上變異為A （丙氨酸），6株變異為T（蘇氨酸），1株變異為M（甲硫氨酸）三種形式。另外有9株病毒在313位氨基酸處出現(xiàn)了一個(gè)新的潛在的糖基化位點(diǎn)。新增糖基化位點(diǎn)的出現(xiàn)可能改變病毒的抗原性并影響受體結(jié)合特性而感染新的宿主。

Sun等[9]對2003～2008年6年間中國北方不同地區(qū)的22株禽源和豬源H9N2毒株分析后也發(fā)現(xiàn)，同一時(shí)期不同地區(qū)病毒株之間同源性較高，但較早期病毒均有不同程度的變異和進(jìn)化。楊婧等[10]對2005年以后的H9N2HA和NA基因同源性關(guān)系研究發(fā)現(xiàn)，H9N2HA和NA基因的變異情況與地域無相關(guān)性，與時(shí)間呈一定的相關(guān)性。由此表明，H9N2發(fā)生變異與時(shí)間呈現(xiàn)一定的相關(guān)性，與地域無關(guān)。本研究中，從進(jìn)化樹分析可知，10株H9N2分離毒HA基因呈現(xiàn)出與分離時(shí)間相近的同源性關(guān)系。

H9N2禽流感病毒在亞洲普遍存在，由于較低的致病性，對人類健康產(chǎn)生的威脅也較低，致使公眾的警惕性不高[11]。Butt等[12]發(fā)現(xiàn)2003年香港感染人類的H9N2禽流感毒株A/Human/Hong Kong/2108/03其HA蛋白的226位即為亮氨酸(L)，而從家禽體內(nèi)分離到的H9N2禽流感毒株A/Gf/Hong Kong/nt184/03其HA蛋白的226位則為谷氨酸(Q)。本研究中，10株H9N2禽流感病毒的226位氨基酸，均為亮氨酸(L)，呈現(xiàn)出典型的人流感受體結(jié)合特性。由此表明2016年山東地區(qū)H9N2具有對哺乳動物的感染性有增高的趨勢，易感染人類，有一定的公共衛(wèi)生危害，因此需要提高對其的重視度。另外還需提防H9N2與其他流感病毒的重組或者抗原漂移現(xiàn)象，以防制造出新流感病毒的風(fēng)險(xiǎn)。已有研究報(bào)道證實(shí)感染人的H5N2、H10N8、H7N9的6個(gè)內(nèi)部基因均來自H9N2亞型禽流感病毒[13]。綜上所述，應(yīng)該加強(qiáng)重視低致病性的H9N2亞型禽流感病毒，防止其打破原有的種間屏障直接傳播給人類和低等哺乳動物，以進(jìn)一步降低其公共危害。