李浩然 ，李哲 ，孟凡生 **，劉世霞

（1.臨沂大學農(nóng)林科學學院，山東 臨沂 276000；2.沂水縣畜牧局，山東 沂水 276403）

雞傳染性支氣管炎病毒 (Chicken infectious bronchitis virus，IBV)，屬冠狀病毒科，冠狀病毒屬的病毒，具有多形性，所引起的疾病是廣泛流行的一種高度接觸性傳染病。目前，雖然已從鴿子和野雞中分離到IBV，但公認雞是IBV主要宿主，可對不同日齡的雞產(chǎn)生不同程度的危害。IBV由于毒株不同分為呼吸性、腎性等10～15型。雞腎型傳染性支氣管炎(infectious bronchitis，NIB)是由嗜腎型傳染性支氣管炎病毒 (infectious bronchitis virus，IBV)引起的雞的一種急性、高致死性、接觸傳染的呼吸道傳染病,腎臟損傷嚴重，而呼吸道損傷較輕，以腎臟腫大呈蒼白色及腎小管內(nèi)尿酸鹽沉積為主要特征。雞感染IBV的腎性毒株后，會發(fā)生間質(zhì)性炎和呼吸道輕微癥狀，伴有中高程度的死亡率，在沒有繼發(fā)感染的情況下，病雞死亡率一般較低。美國學者Winterfield R W等[1]于1962年在美國首次發(fā)現(xiàn)并分離到能引起雞腎病變的IBV，1982年鄺榮祿等[2]首次報道在我國廣東發(fā)現(xiàn)NIBV。1999年，何長生等[3]從以腎腫大或花斑樣腎的呼吸道疾病病例中分離到一株IBV。隨后,國內(nèi)20多個省市相繼報道有NIB發(fā)生[4]。

1 山東臨沂地區(qū)禽病流行情況

山東為全國的家禽養(yǎng)殖大省，而臨沂是山東省主要的家禽養(yǎng)殖基地，以肉雞、蛋雞和水禽為主。據(jù)調(diào)查統(tǒng)計[5]，目前臨沂市禽病主要以新城疫、傳染性支氣管炎、傳染性法氏囊炎為主的病毒病。其中，以傳染性支氣管炎為例，與往年相比，發(fā)病明顯減少，肉雞僅在春天有一定發(fā)病比例，蛋雞在開產(chǎn)前有零星發(fā)病情況，但一般不嚴重，致死率較以前相比，明顯下降。

2 材料

2.1 試驗動物

2.1.1 發(fā)病雞只 山東臨沂地區(qū)4處雞場40日齡自然發(fā)病、臨床上疑似腎型雞傳染性支氣管炎病死雞 120 只， 編號 A1-A30、B1-B30、C1-C30、D1-D30。

2.1.2 SPF雞胚 試驗用 9～12日齡的 SPF雞胚200枚，購自山東省某家禽研究所。

2.2 試驗主要儀器及藥品

2.2.1 試驗儀器 電泳儀：無錫久平儀器有限公司，型號JY-SP12；紫外燈儀：南京順泰科技有限公司；基因擴增儀：龍口市先科儀器公司，型號MG；單人凈化操作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司生產(chǎn)，型號為SW-CJ-1FD；37℃恒溫箱：龍口市電路制造廠生產(chǎn)，型號為YY0027-90；臺式離心機：常州市凱航儀器有限公司,型號KA-1000；孵化機：北京方通孵化機公司，型號FT-XFC3。

2.2.2 試驗藥品 胰蛋白酶：購自上?？祆`生物科技有限公司，工作濃度為1.47%；雞紅細胞：采自江蘇某孵化場正常雞，工作濃度為0.9%；青霉素和鏈霉素：購自魯南制藥集團股份有限公司，工作濃度為950IU；動物疫病基因芯片診斷試劑盒：購自濟南百博生物技術(shù)股份有限公司。

3 方法

3.1 臨床診斷與剖檢 觀察發(fā)病雞臨床癥狀，記錄典型癥狀。

3.2 病料采集處理 取病死雞A組氣管滲出物、病死雞B組肺組織、病死雞C組腎組織、病死雞D組血液，置于勻漿器中（除D組），加少量無菌生理鹽水研磨，制成1：4.5的懸液，反復凍融至少3次后，7800r離心35min，取上清液，加青霉素、鏈霉素各950IU，置 4℃過夜，備用；D組血液在 4℃靜置30min后，1500r離心5min，收集血清，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.3 雞胚傳代 處理液接種5日齡SPF初代雞胚，編號同發(fā)病雞只，尿囊腔接種，每一個胚胎0.2ml，在37℃孵化箱中孵化19d，孵化過程中每6h照蛋1次，24h內(nèi)死亡的雞胚丟棄，死胚尿囊液及時收集，盲傳3代，每一代在37℃孵化箱中孵化24h，孵化過程中每6h照蛋1次，24h內(nèi)死亡的雞胚丟棄，編號與A、B、C組病雞一一對應。

3.4 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應實驗

3.4.1 樣本要求 取3.2所述病料處理樣本。

3.4.2 RNA提取 ①取 被 測 樣 品 200μl，加550μl Tirzol裂解液，上下顛倒混勻，冰上靜置15min；②加1/5volum氯仿，顛倒混勻，冰上靜置15min，4℃，12000r離心 15min；③取上清液 500μl，加入500μl異丙醇，上下顛倒混勻，冰上靜置10min，4℃，12000r離心 15min；④棄上清液，加入75%的冷乙醇 1ml，14℃，12000r離心 5min，棄上清液，室溫靜置3min；⑤加入30μl ddH2O溶解沉淀，所得產(chǎn)物即為RNA溶解液。

3.4.3 反轉(zhuǎn)錄 采用20μl體系。

簡單離心混勻，置于42℃環(huán)境內(nèi)孵育30min，產(chǎn)物置于4℃存放待用（若間隔時間較長，-20℃保存）。

3.4.4 聚合酶鏈式反應 20μl體系。

簡單離心混勻，置于PCR儀中。PCR儀循環(huán)參數(shù)按照以下設(shè)置∶

3.4.5 核酸電泳 ①50XTAE電泳液與ddH2O按1∶50的比例配1XTAE電泳液；②瓊脂糖與電泳液按1∶100的比例配制1%的瓊脂糖膠，倒板前加入7μl核酸染料；③室溫靜置 20min，待瓊脂糖膠凝固， 備用； ④取 PCR產(chǎn)物 8μl與 2μl Loading buffer，吹打混勻加入瓊脂糖凝膠孔；⑤樣品孔前孔加入 3μl 2000PlusⅡMarker；⑥電泳 20min；⑦電泳好的瓊脂凝膠放到紫外燈上觀察結(jié)果。

4 結(jié)果

4.1 臨床及剖檢觀察 發(fā)病雞群表現(xiàn)精神沉郁，下痢，羽毛凌亂，排白色石灰樣糞便，發(fā)病率65%，死亡率約7.5%。剖檢主要病理變化表現(xiàn)為腎腫大、顏色蒼白，呈菜花狀，切面呈“花斑”狀（圖1），腎小管內(nèi)充滿尿酸鹽結(jié)晶；氣管環(huán)輕微出血，氣囊渾濁變厚；輸尿管擴張，內(nèi)有白色柱狀尿酸鹽；泄殖腔內(nèi)有大量乳狀尿酸鹽沉積，肝、肺、腔上囊和腺胃乳頭均正常。部分病、死雞可見氣管環(huán)出血,但無明顯粘液栓存在。

圖1 剖檢病死雞

4.2 雞胚傳代 病料處理液接種SPF雞胚后第一代 5d內(nèi)死亡 5枚；6～11d內(nèi)死亡 2枚，12～19d內(nèi)死亡3枚，胚體表面有散在出血點，初代接種雞胚，少數(shù)發(fā)育受阻(圖2），多數(shù)雞胚存活，符合本病毒特征。第2代接種后6h死亡3枚,7～12h死亡1枚，24h收獲1枚活胚，胚體表面有少量出血點。第3代接種后6h收獲1枚死亡胚，胚體后腦及背部有點狀出血。第4代接種后12h內(nèi)死亡2枚，24h收獲1枚活胚，胚體全身有出血點（圖3）。

圖3 收獲活胚，胚體表面有出血點

4.3 PCR 根據(jù)圖4凝膠電泳試驗結(jié)果顯示，本試驗提取的病毒為IBV陽性，即該病毒為雞腎型傳染性支氣管炎病毒。

圖4 PCR結(jié)果

5 防治

5.1 預防 加強雞場飼養(yǎng)管理，定期消毒，嚴格執(zhí)行隔離、檢疫等衛(wèi)生防疫措施。降低飼養(yǎng)密度，保持適宜溫度，減少各種應激，合理配比飼料，防治維生素缺乏。

目前該病的預防疫苗主要有M41的弱毒苗，如H120、H52及多價滅活疫苗[15]。因為IBV血清型多，各型間幾乎無交叉免疫，所以盲目引進腎型IBV疫苗，有可能會起到適得其反的作用，一般認為M41型對其他型病毒有交叉免疫作用，所以必須掌握流行的血清型，選擇和使用與當?shù)氐难逍鸵恢碌囊呙缰辍120一般應用于雛雞，因其毒力相對較弱，對雛雞更為安全；H52毒力較強，一般應用于20日齡以上雞。在飼喂管理上，用玉米粉代替蛋白質(zhì)飼料以減輕腎臟的負擔，同時，小蘇打或電解質(zhì)飲水，2～3d后癥狀有所緩解。必要的時候也可以在飼料中添加主治該病的中藥，如黃芪、黨參、金銀花、連翹等。

為防止加重腎臟負擔，使死亡數(shù)量增加[6]應避免使用有腎毒性的抗生素。提取病雞的病料分離病毒并用分離鑒定過的毒株做成自家苗在開產(chǎn)前和雛雞階段進行免疫，能有效的預防感染IBV。

5.2 治療 對病雞主要是對癥治療和防止繼發(fā)感染，可使用廣譜抗生素如0.01%強力霉素或0.005%恩諾沙星飲水等，對腎型IBV除防止繼發(fā)感染外，可在飲水中加入水溶性多維素以及烏洛托品或含有檸檬酸鹽的復方藥物等，以保腎、補液，促進尿酸鹽排出。對于嚴重病例，采取緊急措施，必要時應及時淘汰。

6 總結(jié)和討論

根據(jù)實驗中所觀察的剖檢結(jié)果及通過各項鑒定數(shù)據(jù)方法所得的數(shù)據(jù)分析，確定分離所得病毒為雞腎型傳染性支氣管炎病毒，本實驗中的主要病變在腎臟和呼吸道。腎病變型支氣管炎除呼吸器官病變外，可見腎腫大，腎小管內(nèi)尿酸鹽沉積而擴張，腎呈花斑狀，輸尿管尿酸鹽沉積而變粗；心、肝和脾臟表面也有沉積的尿酸鹽似一層白霜；有時可見法氏囊有炎癥和出血癥狀；病雞排白色稀糞。但本病臨床診斷意義不大，應注意同中毒性疾病、減蛋綜合征等其它疾病區(qū)分。

實驗表明，腎型IBV呼吸道癥狀明顯，潛伏期約1～7d。然后雞出現(xiàn)了嚴重的腹瀉，甚至死亡，病程約21d。調(diào)查過程中發(fā)現(xiàn)，在腎型IBV流行特點主要是發(fā)生在2～6周齡以內(nèi)的雛雞，20%～45%的死亡率，呼吸道癥狀呈一過性。

本病目前還無特效療法的報道，因此，應重視早期臨床癥狀觀察和流行病學調(diào)查，結(jié)合解剖特征、分子生物學診斷，對疾病進行早期控制；當出現(xiàn)有疑似患病雞群時，應及時采取治療措施，必要時進行捕殺，防止病原擴散，將危害程度最小化。