劉應蛟 楚世峰 胡耀梅 裴剛 周小江 陳乃宏

〔摘要〕 目的 建立中藥玄參中阿魏酸和肉桂酸的HPLC含量測定方法，觀察其水解前后的變化，以及對魚藤酮和去血清模型的神經保護作用。方法 采用Agilent 5 TC-C18柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm），以乙腈-0.05%磷酸溶液為流動相，梯度洗脫，檢測波長為290 nm，柱溫30 ℃;建立體外魚藤酮及去血清模型，用不同濃度阿魏酸和肉桂酸預處理，以MTT法測定細胞存活率。結果 阿魏酸和肉桂酸水解前后回收率分別為98.20%和91.41%、97.22%和90.96%，RSD均未超過2.0%，6批不同產地藥材中阿魏酸和肉桂酸水解前后的含量分別為0.028%～0.041%和0.073%～0.102%、0.035%～0.142%和0.163%～0.336%。阿魏酸（10 μmol/L）可顯著增加去血清和魚藤酮處理細胞的存活率（P<0.01）;肉桂酸（0.1 μmol/L）能明顯增加魚藤酮處理細胞的存活率（P<0.05）。結論 本方法簡便、精密度高、重現性好，為玄參中具神經保護作用的阿魏酸和肉桂酸動態(tài)變化提供科學依據。

〔關鍵詞〕 玄參;阿魏酸;肉桂酸;高效液相色譜;神經保護

〔中圖分類號〕R284.1;285.5? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.12.009

中藥玄參為玄參科Scrophulariaceae玄參屬Scrophularia植物玄參Scrophularia ningpoensis Hemsl.的干燥根。玄參藥用始載于《神農本草經》，列為中品，又名“元參”“黑參”等， 歷代藥典都有收載，現收載于2015 版《中華人民共和國藥典》一部。其性微寒，味甘、苦、咸，歸肺、脾、腎經，具有清熱涼血，滋陰降火，解毒散結功能[1]。玄參為我國特產，現主要分布于貴州、浙江、陜西、湖南、四川、湖北、江蘇等地。研究發(fā)現玄參含有環(huán)烯醚萜類、苯丙素類、有機酸類、揮發(fā)油以及黃酮類等多種成分，環(huán)烯醚萜類含有哈巴苷，哈巴俄苷、8-O-阿魏?；淋铡?'-O-肉桂?；蛙盏瘸煞?其中苯丙素類含有斬龍劍苷A（6-O-反式肉桂?；?1-O-α-D-果糖基-β-D-葡萄糖）、ningposide A（3-O-乙?；?2-O-阿魏?；?α-L-鼠李糖）等;有機酸類含較多的肉桂酸和阿魏酸等[2]。環(huán)烯醚萜類容易受到光、熱、氧與酶的影響從而氧化或水解;苯丙素類容易在強堿溶液中水解。玄參中環(huán)烯醚萜類和苯丙素類結構中大多數含有阿魏?；凸鹌；?，水解產物可得到阿魏酸和肉桂酸，如哈巴俄苷發(fā)生水解可生成哈巴苷和肉桂酸[3]。阿魏酸具有抗氧化、抗腫瘤和抗衰老等活性[4]，金蓓蓓等[5]提出阿魏酸具有改善學習記憶和保護腦的作用;肉桂酸是誘導分化劑，能夠誘導分化腫瘤細胞[6]，曾勝男等[7]認為肉桂酸衍生物對大鼠腦卒中有保護作用。本文采用RP-HPLC梯度洗脫方法對不同產地玄參藥材中水解前和水解后的阿魏酸和肉桂酸進行含量測定并比較，并對其體外神經保護活性進行測定，以期為控制玄參藥材的質量和臨床應用奠定基礎。

1 儀器與試藥

1.1? 儀器

高效液相色譜儀（Agilent 1260）;電子分析天平（METTLER TOLEDO XS205）;CO2培養(yǎng)箱、臺式高速微量冷凍離心機（美國Thermo）;全功能微孔板檢測儀（美國Bio-TEK）。

1.2? 試藥

阿魏酸（批號：110773-201614，質量分數99.0%），肉桂酸對照品（批號：110786-201604，質量分數98.8%） 均為中國食品藥品檢定研究院提供。PC12細胞（大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞）由中國醫(yī)學科學院協(xié)和醫(yī)院藥物研究所提供。魚藤酮、MTT、多聚賴氨酸、胰酶來自美國Sigma公司;1640完全培養(yǎng)基、FBS、ES、三聯液來自美國HyClone公司;乙腈、甲醇、乙酸乙酯、乙醚、氫氧化鈉、氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀等來自國藥集團化學試劑有限公司，均為分析純試劑。6份不同來源玄參飲片， 經湖南中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室周小江教授鑒定為玄參科Scrophulariaceae植物玄參Scrophularia ningpoensis Hemsl.飲片正品。

2 方法與結果

2.1? 色譜條件

色譜柱：Agilent 5 TC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），檢測波長為290 nm;柱溫30 ℃;流動相為 水（A）-乙腈（B），梯度洗脫0～15 min，13%B→13%B;15～20 min，13%B→20%B;20～25 min，20%B→35%B;25～35 min，35%B→70%B;35～40 min，70%B→13%B;流速：1 mL/min;進樣量：20 μL。

2.2? 對照品混合溶液的制備

精密稱取阿魏酸和肉桂酸對照品適量， 置棕色容量瓶中加甲醇配制成濃度分別為146.5 μg/mL和86.9 μg/mL的貯備溶液。

2.3? 供試品溶液的制備

2.3.1? 未水解? 取玄參藥材粉末適量，過3號篩，稱取約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加70%甲醇25 mL，稱重，超聲1 h，再稱重，用甲醇補重，搖勻，濾過。

2.3.2? 水解? 精密量取“2.3.1”項下的續(xù)濾液5 mL，水浴蒸干。殘渣用10%氫氧化鈉溶液30 mL 分3 次溶解， 轉移回流燒瓶中，水浴回流3 h，放冷。移入分液漏斗中， 用5 mL水洗滌燒瓶，洗滌液并入分液漏斗中，用鹽酸調pH 2，乙酸乙酯萃取4 次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，在50～60 ℃水浴上蒸至近干， 置20 mL容量瓶中用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻即得。

2.4? 方法學考察

2.4.1? 標準曲線的制備? 精密吸取上述對照品混合溶液0.5、1.0、2.0、3.0、5.0、6.0 mL分別置10 mL容量瓶中用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻即得，編號1～6。注入高效液相色譜儀，以對照品濃度對峰面積繪制標準曲線進行線性回歸，得到阿魏酸的回歸方程為

Y=733 78X+37.186，r=0.999 1

在濃度7.32～87.92 μg/mL范圍內線性關系良好;肉桂酸的回歸方程為

Y=114 168X+46.237，r=0.999 7

在濃度4.35～52.17 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.4.2? 穩(wěn)定性試驗? 分別精密吸取1號供試品水解前后的溶液，按照“2.1”項色譜條件進行實驗，并于0、1.5、3、6、12、24 h，測定，根據阿魏酸和肉桂酸的峰面積，計算其水解前后的RSD分別為0.78%和0.56%、1.26%和1.60%。

2.4.3? 精密度試驗? 分別精密吸取上述1號對照品溶液，按照“2.1”項色譜條件，測定阿魏酸和肉桂酸的含量，重復6次，分別計算其RSD為0.72%和0.77%。

2.4.4? 重復性試驗? 取1號供試品粉末各6份，按照供試品溶液的制備方法“2.3.1”和“2.3.2”進行，測定阿魏酸和肉桂酸的含量，分別計算其水解前后的RSD為0.52%和1.05%、1.46%和1.39%。

2.4.5? 回收率試驗? 精密稱取9份1號供試品粉末，每份約1 g，分別精密加入對照品溶液3個濃度（相當于50%、100%、150%濃度水平），平行3份，按照供試品溶液的制備方法“2.3.1”和“2.3.2”進行，過0.45 μm濾膜，測定。結果見表1。

回收率=（測得總含量-樣品中含量）/加入量×100%

2.5? 含量測定

精密稱取各產地玄參粉末（過三號篩），按照供試品溶液的制備方法“2.3.1”和“2.3.2”進行，過0.45 μm微孔濾膜，測定并計算其含量，結果見表2、圖1。

2.6? 神經保護活性

2.6.1? 細胞培養(yǎng)及分組? 將置液氮中凍存的PC12細胞取出，放入37 ℃下快速解凍并移入15 mL離心管中，1 000 r/min，離心5 min并棄去上清。加入完全培養(yǎng)基（含10% ES和5% FBS的1 640培養(yǎng)基）后吹散重懸，移入培養(yǎng)瓶中，置5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后換液;當細胞長至80%～90%匯合度時，倒掉培養(yǎng)液后，用PBS輕輕洗1遍細胞，然后用0.05%胰酶消化1 min，待細胞完全消化后用完全培養(yǎng)基終止消化，離心并棄去上清，用完全培養(yǎng)基吹散重懸，穩(wěn)定培養(yǎng)3代。將96孔板中間60孔中，每孔加入100 μL PLL，在37 ℃包被4 h后，用100 μL PBS洗板2次，紫外照射0.5 h，然后稀釋成1×105 個/mL的細胞濃度按每孔100 μL鋪板，孵育24 h后用于實驗。分8組培養(yǎng)，每組6孔，設對照組、模型組和模型加藥物組，模型加藥物組分別加入0.1、1、10 μmol/L的肉桂酸和阿魏酸。加完后，在培養(yǎng)箱中放置24 h。

2.6.2? 細胞模型制備? 去血清模型：將完全培養(yǎng)基換成無血清1 640培養(yǎng)基;魚藤酮模型：用完全培養(yǎng)基稀釋成4 μmol/L魚藤酮的液體。

2.6.3? MTT法檢測細胞活性? 在藥物處理終止時，每孔加入10 μL MTT液（用PBS配成5 mg/mL的液體），放在培養(yǎng)箱里4 h，然后再加入三聯液 100 μL，6～8 h后用酶標儀在570 nm波長處檢測樣品的OD值[8]。

細胞相對存活率=（實驗組平均OD值/對照組平均OD值）×100%

如圖2所示，經魚藤酮干預和去血清后，PC12細胞存活率均顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，去血清模型中0.1、1、10 μmol/L肉桂酸組的細胞存活率沒有明顯變化（P>0.05），10 μmol/L阿魏酸組的細胞存活率顯著升高（P<0.01）;而在魚藤酮模型中0.1 μmol/L肉桂酸組能明顯提高細胞存活率（P<0.05），10 μmol/L阿魏酸組能顯著升高細胞存活率（P<0.01）。

3 討論

3.1? 流動相選擇

分別考察流動相甲醇∶0.05%磷酸溶液、乙腈∶0.05%磷酸溶液、甲醇∶水、乙腈∶水，其中以乙腈∶0.05%磷酸溶液為流動相梯度洗脫，樣品中各峰分離效果最佳。

3.2? 波長選擇

肉桂酸在203、215、272 nm處，阿魏酸在217、234、290、322 nm處有最大吸收。樣品在217 nm處基線漂移，并且樣品雜峰比較多，272 nm處正好在阿魏酸峰谷附近，因而選取290 nm作為測定波長。

3.3? 選擇30%、50%、70%和100%甲醇4個不同濃度進行提取，結果30%甲醇提取的玄參異香草酸峰面積較大，50%甲醇適合于異香草酸、阿魏酸和肉桂酸3者峰面積整體較大，70%甲醇提取的玄參阿魏酸和肉桂酸峰面積較大，由于異香草酸含量比較低，未達到定量要求，因而選擇70%甲醇提取對阿魏酸和肉桂酸同時測定;對回流、超聲提取方法進行了比較，結果超聲法提取樣品測得的峰面積高于回流法;選擇不同超聲提取時間（1、2、3 h），結果超聲2 h即能提取完全;同時對樣品進行未過夜和過夜處理，過夜處理的樣品峰面積約高于未過夜的1.5倍，因而選擇樣品放置暗處過夜處理，并且在提取過程中應注意避免陽光或者日光燈照射。

3.4? 本實驗對樣品水解條件采用氫氧化鈉濃度分別為2%，5%和10%，以及水解時間2.5、3.0、3.5 h，并用稀鹽酸調pH1、pH2和pH3進行比較，結果10%氫氧化鈉溶液，水解時間3.0 h，用稀鹽酸調pH1水解比較徹底。通過對比萃取試劑乙醚和乙酸乙酯，由于乙醚為易制毒試劑，并且乙酸乙酯整體上優(yōu)于乙醚，因而乙酸乙酯可以替代乙醚。

3.5? PC12細胞常用于代替神經細胞的研究，去血清模型是研究神經營養(yǎng)因子剝奪性損傷的病理模型，魚藤酮模型可以特異性地損傷黑質多巴胺能神經元[9]。實驗結果表明：10 μmol/L阿魏酸在兩種細胞模型中具有顯著的神經保護作用，這與徐富翠等[10]在缺氧培養(yǎng)模型的結果一致。隨著阿魏酸濃度升高，神經保護作用增強，與黃浩等[11]同樣認為不同濃度的阿魏酸對PC12細胞神經保護作用呈劑量依賴關系;肉桂酸（0.1 μmol/L）僅在魚藤酮損傷模型中有明顯的神經保護作用，但濃度增強后，保護作用消失，可能是肉桂酸濃度升高具有一定拮抗性作用，李曉東等[12]研究認為低濃度起促進，高濃度起抑制的雙重作用。因而阿魏酸和肉桂酸量效關系還有待進一步深入研究。為了得到更多的阿魏酸和肉桂酸，可通過10%氫氧化鈉溶液水解，阿魏酸和肉桂酸含量分別增加2.0～2.6倍和2.6～4.7倍。對比圖1 B、C中1號峰水解后含量增加，可能是8-O-阿魏?；蛙眨?''-0-阿魏?；蛙眨瑪佚垊誂等含阿魏?；沫h(huán)烯醚萜類或苯丙素類化合物在受熱或強堿溶液條件下發(fā)生水解，使阿魏酸含量增加。由于C中的3號峰水解完全，使2、4號峰含量明顯增加，因為哈巴俄苷在強堿作用下加熱水解為肉桂酸和哈巴苷，通過比較水解前后肉桂酸含量，發(fā)現水解后肉桂酸含量的增加主要取決于哈巴俄苷含量的高低，極少量可能是通過其它含肉桂?；舛鴣?。

玄參中主要含有環(huán)烯醚萜類和苯丙素類[13]，其結構中大多數含有阿魏?；凸鹌；?，水解產物可得到阿魏酸和肉桂酸。綜上所述，通過10%氫氧化鈉溶液水解可以提高玄參中阿魏酸和肉桂酸含量，對去血清和魚藤酮模型具神經保護作用，為玄參的質量與臨床應用提供科學依據。

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