張赟赟 楊海船 周萍 何春歡 嚴(yán)赟

中圖分類號(hào) R914.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）19-2667-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.19.17

摘 要 目的：對(duì)壯瑤藥材馬蹄蕨的多糖成分進(jìn)行提取分離純化，并建立同時(shí)測定其中鼠李糖、果糖和D-無水葡萄糖3種單糖含量的方法。方法：優(yōu)化水提醇沉法提取馬蹄蕨多糖，比較不同型號(hào)大孔樹脂除蛋白效果，并考察DEAE-52纖維素柱純化所用不同洗脫液。采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法進(jìn)行含量測定。色譜柱為ZORBAX NH2，流動(dòng)相為乙腈-水（72 ∶ 28，V/V），流速為0.8 mL/min，柱溫為40 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。漂移管溫度為50 ℃，載氣流速為2.0 L/min，增益為1。結(jié)果：采用水提75%乙醇沉淀提取馬蹄蕨粗多糖，D101大孔樹脂除蛋白質(zhì)，DEAE-52纖維素柱純化，并依次用蒸餾水、0.2 mol/L NaCl、0.2 mol/L NaOH溶液進(jìn)行洗脫，冷凍干燥，即得馬蹄蕨多糖。鼠李糖、果糖和D-無水葡萄糖檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為49.10～982.02、54.47～1 089.42、62.15～1 242.96 μg/mL（r≥0.999 6）；檢測限分別為7.4、3.2、4.4 μg/mL，定量限分別為24.4、10.6、14.5 μg/mL；精密度、穩(wěn)定性（15 h）試驗(yàn)的RSD均<2%（n=6）；重復(fù)性試驗(yàn)的RSD<3%（n=6）；平均加樣回收率分別為96.91%、97.43%、99.46%，RSD分別為1.3%、1.7%、2.2%（n=6）。結(jié)論：建立的多糖提取分離工藝簡單，易操作；高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法操作簡單，結(jié)果準(zhǔn)確度高，可用于馬蹄蕨多糖的提取純化及其中3種單糖的定量分析。

關(guān)鍵詞 馬蹄蕨；壯瑤藥材；多糖；提取分離；含量測定；高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法

ABSTRACT OBJECTIVE： To extract， separate and purify the polysaccharides from Zhuang and Yao medicine Angiopteris fokiensis， and to establish a method for simultaneous determination of isodulcite， fructose and D-anhydrous glucose in 3 kinds of monosaccharide. METHODS： Optimization of water extraction and alcohol precipitation for extracting A. fokiensis polysaccharide，compare the effect of different types of macroporous resin on protein removal， and investigate the different eluents used in the purification of DEAE-52 cellulose column. HPLC-ELSD method was used. The determination was performed on ZORBAX NH2 column with mobile phase consisted of acetonitrile-water （72 ∶ 28， V/V） at the flow rate of 0.8 mL/min. The column temperature was 40 ℃ and sample size was 10 μL. The drift tube temperature was 50 ℃， the carrier gas velocity was 2.0 L/min， and the gain was 1. RESULTS： Extraction of crude polysaccharides from the horseshoe fern by water extraction with 75% ethanol， D101 macroporous resin in addition to protein，DEAE-52 cellulose column for purification， and eluted sequentially with distilled water， 0.2 mol/L NaCl， and 0.2 mol/L NaOH solution， freeze-dried to obtain the A. fokiensis polysaccharide. The linear range of isodulcite， fructose and D-anhydrous glucose were 49.10-982.02 μg/mL， 54.47-1 089.42 μg/mL， 62.15-1 242.96 μg/mL （r≥0.999 6）. The detection limits were 7.4， 3.2 and 4.4 μg/mL， and the quantitation limits were 24.4， 10.6， 14.5 μg/mL. RSDs of precision and stability （15 h） test results were all lower than 2% （n=6）. RSDs of reproducibility tests were all lower than 3% （n=6）. The average recoveries were 96.91%， 97.43% and 99.46%； RSD were 1.3%， 1.7%， 2.2%（n=6）， respectively. CONCLUSIONS： The extraction and isolation technology of polysaccharides are simple and simple to operate. The HPLC-ELSD method is simple， accurate and suitable for the separation and purification of polysaccharides from A. fokiensis and quantitative analysis of 3 kinds of monosaccharides.

KEYWORDS Angiopteris fokiensis； Zhuang and Yao medicine； Polysaccharide； Extraction and separation； Content determination； HPLC-ELSD

馬蹄蕨是觀音座蓮科植物福建蓮座蕨（Angiopteris fokiensis Hieron.）的根狀莖[1]，又名蹄馬草[2]、山馬蹄、胃得密[3]等，以帶葉柄的根莖入藥。馬蹄蕨具有清熱解毒、涼血止血、收斂消腫等功效，主要用于治療腸炎、淋巴結(jié)腫大、風(fēng)熱咳嗽、月經(jīng)過多、功能性子宮出血、風(fēng)濕骨痛、毒蛇咬傷、癰瘡腫毒[3]。馬蹄蕨作為壯瑤民間藥材應(yīng)用較為廣泛，但是其化學(xué)成分研究資料較少[4]，其多糖成分的相關(guān)報(bào)道更為鮮見。筆者在對(duì)馬蹄蕨化學(xué)成分研究過程中發(fā)現(xiàn)，馬蹄蕨中含有多糖成分，本項(xiàng)目組通過藥效學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，馬蹄蕨多糖具有較強(qiáng)的免疫活性和一定的抗腫瘤活性。為在今后的藥效學(xué)研究中提供質(zhì)量穩(wěn)定的馬蹄蕨多糖樣品，保證試驗(yàn)數(shù)據(jù)的有效性，本研究對(duì)馬蹄蕨的多糖進(jìn)行了提取純化工藝研究，并建立其中鼠李糖、果糖和D-無水葡萄糖等3種單糖的含量測定方法，以期為馬蹄蕨多糖的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究和質(zhì)量控制提供分析技術(shù)手段。

1 材料

1.1 儀器

1260高效液相色譜儀，包括G1311C四元梯度泵、Alltech3300蒸發(fā)光散射檢測器、G1329B自動(dòng)進(jìn)樣器、ChemStation色譜工作站（美國Agilent公司）；XS205DU十萬分之一天平[梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司]；B2200S超聲波清洗器（必能信超聲有限公司）；Alpha 2-4 LD plus 冷凍干燥機(jī)（德國Marin Christ公司）；Kjeltec 8400全自動(dòng)定氮儀（丹麥福斯分析儀器公司）。

1.2 藥品與試劑

馬蹄蕨藥材[批號(hào)：20151009，2015年10月采于廣西百色田林縣，由廣西中醫(yī)藥研究院黃云峰副研究員鑒定為馬蹄蕨（Angiopteris fokiensis Hieron）的根狀莖]；D-無水葡萄糖對(duì)照品（批號(hào)：110833-201506，純度：99.9%）、果糖對(duì)照品（批號(hào)：100231-201305，純度：99.4%）均購于中國食品藥品檢定研究院；鼠李糖對(duì)照品（批號(hào)：C16813500，純度：98.3%）購于德國Dr Ehrenstofer 公司；大孔樹脂D101、D301-R、AB-8、717、732（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）；DEAE-52纖維素（上海寶曼生物科技有限公司）；乙腈為色譜純，95%乙醇、氯仿、正丁醇、硫酸、鹽酸（HCl）、氯化鈉（NaCl）、氫氧化鈉（NaOH）、蒽酮均為分析純，水為蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 馬蹄蕨多糖的制備

2.1.1 馬蹄蕨粗多糖的提取 （1）水提醇沉方法的優(yōu)化 。藥材除脂預(yù)處理：馬蹄蕨藥材切片曬干，加入8倍量的95%乙醇，60 ℃加熱回流2 h，過濾，藥渣晾干，保留，備用。

根據(jù)植物多糖水溶醇不溶的特點(diǎn)，本研究采用水提醇沉的方法進(jìn)行馬蹄蕨粗多糖的提取。以得膏率（得膏率=得膏質(zhì)量/藥材質(zhì)量×100%）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察不同體積分?jǐn)?shù)醇沉對(duì)粗多糖得膏率的影響，結(jié)果表明，75%乙醇沉淀的得膏率最佳，因此本研究醇沉體積分?jǐn)?shù)選擇75%。不同體積分?jǐn)?shù)醇沉結(jié)果見表1。

（2）馬蹄蕨粗多糖的提取方法。馬蹄蕨藥材切片曬干，加入8倍量乙醇回流提取2 h，過濾，藥渣晾干。藥渣采用8倍量熱水浸提3次，每次2 h，過濾，合并濾液，濃縮濾液至一定體積，緩緩加入乙醇，使乙醇含量達(dá)到75%以上，密封靜置24 h，收集沉淀，冷凍干燥，即得。

2.1.2 馬蹄蕨多糖的分離純化 （1）馬蹄蕨多糖除蛋白。取馬蹄蕨粗多糖適量，蒸餾水溶解，量取100 mL，平行5份，分別上樣于D101、D301-R、AB-8、717、732等5種型號(hào)大孔樹脂（各10 mL），靜置過夜，蒸餾水沖洗至未有多糖檢出，合并各洗脫液，濃縮。采用全自動(dòng)定氮儀測定蛋白質(zhì)含量，計(jì)算各樹脂的蛋白質(zhì)吸附量[蛋白質(zhì)吸附量=（上柱前蛋白質(zhì)質(zhì)量-過柱后蛋白質(zhì)質(zhì)量）/大孔樹脂質(zhì)量]；采用蒽酮-硫酸法測定總多糖含量[5]，計(jì)算多糖吸附量[多糖吸附量=（上柱前多糖質(zhì)量-過柱后多糖質(zhì)量）/大孔樹脂質(zhì)量]，篩選最優(yōu)大孔吸附樹脂。結(jié)果表明，D101大孔吸附樹脂具有較好的除蛋白作用，且多糖吸附量最少。因此，本研究選擇D101大孔吸附樹脂除蛋白。不同型號(hào)大孔樹脂除蛋白質(zhì)試驗(yàn)結(jié)果見表2。

（2）DEAE-52纖維素柱層析。量取已進(jìn)行除蛋白處理的多糖液20 mL，采用DEAE-52纖維素柱進(jìn)行分級(jí)純化，依次用200 mL蒸餾水、0.2 mol/L NaCl、0.2 mol/L NaOH、0.2 mol/L HCl溶液作為洗脫液進(jìn)行洗脫，控制流速，每20 mL收集一管，用蒽酮-硫酸法跟蹤檢測，合并所有正態(tài)峰的收集液，透析膜透析24 h，減壓濃縮，醇沉冷凍干燥，即得馬蹄蕨多糖。結(jié)果，蒸餾水洗脫部分得多糖47.49 mg，0.2 mol/L NaCl洗脫部分得多糖43.12 mg，0.2 mol/L NaOH洗脫部分得多糖33.39 mg，0.2 mol/L HCl洗脫部分得多糖1.01 mg，表明蒸餾水、0.2 mol/L NaCl、0.2 mol/L NaOH溶液已將多糖洗脫完全。因此，本研究選擇蒸餾水、0.2 mol/L NaCl、0.2 mol/L NaOH溶液作為洗脫液。本步驟得率為6.25%。

（3）馬蹄蕨多糖分離純化方法。由上述試驗(yàn)結(jié)果總結(jié)出馬蹄蕨多糖的分離純化步驟為：取馬蹄蕨粗多糖，蒸餾水溶解，上樣于D101大孔吸附樹脂，蒸餾水沖洗至未有多糖檢出，合并洗脫液，濃縮。隨后，采用DEAE-52纖維素柱進(jìn)行分級(jí)純化，依次用蒸餾水、0.2 mol/L NaCl、0.2 mol/L NaOH溶液作為洗脫液進(jìn)行洗脫，用蒽酮-硫酸法跟蹤檢測，合并所有正態(tài)峰的收集液，透析膜透析24 h，減壓濃縮，冷凍干燥，即得馬蹄蕨多糖。

2.2 馬蹄蕨多糖中鼠李糖、果糖和D-無水葡萄糖的含量測定

為更清楚地研究馬蹄蕨多糖的組成及控制其質(zhì)量，本研究組通過預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)馬蹄蕨多糖中含有鼠李糖、果糖和D-無水葡萄糖 3 種單糖，因此本研究以此 3 種單糖作為質(zhì)量控制指標(biāo)建立馬蹄蕨多糖的含量測定方法。

2.2.1 色譜及檢測器條件 色譜柱：ZORBAX NH2（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（72 ∶ 28，V/V）；流速：0.8 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。蒸發(fā)光散射檢測器的檢測條件：漂移管溫度為50 ℃，載氣流速為2.0 L/min，增益為1。

2.2.2 溶液的制備 （1）對(duì)照品溶液。稱取鼠李糖對(duì)照品49.95 mg、果糖對(duì)照品54.80 mg和D-無水葡萄糖對(duì)照品62.21 mg，分別置于50 mL量瓶中，以乙腈-水（50 ∶ 50，V/V）溶解并定容至刻度，配制成單一對(duì)照品貯備液，備用。以下不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液由單一對(duì)照品貯備液稀釋得到。

（2）供試品溶液。稱取馬蹄蕨多糖約0.5 g，精密稱定，置于20 mL量瓶中，加入10 mL蒸餾水，于60 ℃水浴中加熱5 min，取出，超聲（功率：100 W，頻率：40 kHz）提取10 min，放冷，流動(dòng)相定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

（3）空白溶液。取流動(dòng)相適量作為空白溶液。

2.2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 精密量取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液、供試品溶液和空白溶液各適量，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜。結(jié)果，在該色譜條件下，各待測成分間、待測成分與雜質(zhì)峰間均能達(dá)到基線分離，分離度>1.7，其他成分對(duì)待測成分的測定無干擾，理論板數(shù)以D-無水葡萄糖峰計(jì)>5 000，詳見圖1。

2.2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.2.2（1）” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液各0.5、1.0、2.0、3.0、5.0、10.0 mL，置于10 mL量瓶中，用乙腈-水（50 ∶ 50，V/V）定容，制成系列對(duì)照品溶液。精密量取上述系列對(duì)照品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以待測成分檢測質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)（x）、峰面積為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸，得鼠李糖、果糖和D-無水葡萄糖的回歸方程分別為y=9.406 3×103x+376.1（r=0.999 7）、y=6.332 5×103x-743.8（r=0.999 7）、y=8.056 7×103x+3 907.2（r=0.999 6）。結(jié)果表明，鼠李糖、果糖和D-無水葡萄糖檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為49.10～982.02、54.47～1 089.42、62.15～1 242.96 μg/mL。

2.2.5 檢測限與定量限考察 取“2.2.2（1）”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為3 ∶ 1 時(shí)，得檢測限；當(dāng)信噪比為10 ∶ 1 時(shí)，得定量限。結(jié)果，鼠李糖、果糖和D-無水葡萄糖的檢測限分別為7.4、3.2、4.4 μg/mL，定量限分別為24.4、10.6、14.5 μg/mL。

2.2.6 精密度試驗(yàn) 取“2.2.2（1）”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，鼠李糖、果糖和D-無水葡萄糖峰面積的RSD分別為1.07%、0.48%和0.97%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.2（2）”項(xiàng)下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0、1、2、5、8、15 h時(shí)按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，鼠李糖、果糖和D-無水葡萄糖峰面積的RSD分別為1.89%、0.99%和1.67%（n =6），表明供試品溶液在室溫下放置15 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.2.2（2）”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量。結(jié)果，鼠李糖、果糖和D-無水葡萄糖含量的平均值分別為4.96、6.86、6.83 mg/g，峰面積的RSD分別為1.77%、1.30%和2.52%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.9 加樣回收試驗(yàn) 稱取馬蹄蕨多糖約0.25 g，精密稱定，共6份，精密加入“2.2.2（1）”項(xiàng)下對(duì)照品貯備液各1.5 mL。按“2.2.2（2）”項(xiàng)下供試品溶液方法制備，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表3。

2.2.10 樣品含量測定 取馬蹄蕨多糖，按“2.2.2（2）”項(xiàng)下供試品溶液方法制備，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量。結(jié)果，馬蹄蕨多糖中鼠李糖、果糖和D-無水葡萄糖的含量分別為4.96、6.86、6.83 mg/g（n=3）。

3 討論

3.1 馬蹄蕨粗多糖分離純化的處理

植物多糖的提取分離純化過程是多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性研究的基礎(chǔ)，通過水提醇沉得到的粗多糖中混雜著色素、蛋白質(zhì)、低聚糖等雜質(zhì)，因此需要進(jìn)行分離純化處理。在本研究中，筆者采用大孔樹脂吸附法除多糖蛋白質(zhì)，使用蒸餾水作為洗脫溶劑，避免了Sevag試劑法、三氟乙酸法等帶入有機(jī)試劑、易使多糖結(jié)構(gòu)發(fā)生變化等因素，且大孔吸附樹脂也在一定程度上能將色素與多糖分離[5]，在后期的生物活性研究中，減少了試劑和結(jié)構(gòu)變化對(duì)藥效結(jié)果的影響因素。

3.2 檢測方法的選擇

目前，對(duì)多糖的測定方法有硅膠薄層色譜法[6]、分光光度法[7-9]、氣相色譜法[10-11]、液相色譜-紫外檢測法[12-13]、液相色譜-蒸發(fā)光檢測法[14-15]、液相色譜-質(zhì)譜檢測法[16-17]等。在實(shí)際操作中，薄層色譜法受展開劑與色譜板的局限，準(zhǔn)確性較差；分光光度法只能測定總糖含量，操作復(fù)雜，且重現(xiàn)性差；氣相色譜法和液相色譜-紫外檢測法在樣品前處理時(shí)均需衍生化，且衍生化反應(yīng)耗時(shí)長、操作復(fù)雜、重現(xiàn)性差；液相色譜-蒸發(fā)光檢測法和液相色譜-質(zhì)譜檢測法均不需要對(duì)樣品進(jìn)行衍生化，可直接提取進(jìn)樣，但是質(zhì)譜法的儀器昂貴，成本較高，普及率不高。而蒸發(fā)光散射法由于近年來儀器的普及，目前可作為糖類定量分析的主流方法。本文采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法檢測馬蹄蕨多糖中3種多糖的含量，考察了乙腈-水、乙腈-0.2%三乙胺的流動(dòng)相及不同提取時(shí)間。結(jié)果顯示，在上述色譜條件下，等度洗脫就能將樣品峰較好地分離，因此最終確定了本試驗(yàn)的色譜條件。

綜上所述，馬蹄蕨多糖提取分離工藝簡單，易操作；高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法操作簡單，結(jié)果準(zhǔn)確度高，可用于馬蹄蕨多糖的提取純化及其中3種單糖的定量分析。

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（收稿日期：2018-06-11 修回日期：2018-08-07）

（編輯：余慶華）