郝彬　趙紅果

摘要 目的：探討牛蒡子苷元對(duì)體外C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抑制效果和凋亡機(jī)制。方法：將牛蒡子苷元作用于C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞，采用CCK-8法測(cè)定各組細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)TNF-α、IL-2的水平；Western blot檢測(cè)Bax、Bcl-2、NF-кB蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：與空白組比較，牛蒡子苷元組（2.5～40 μmol/L）顯著抑制C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，其誘導(dǎo)效應(yīng)具有濃度依賴性；牛蒡子苷元處理后，細(xì)胞中TNF-α、IL-2水平增加；牛蒡子苷元可以顯著上調(diào)Bax蛋白表達(dá)，下調(diào)Bcl-2、NF-кb蛋白表達(dá)。結(jié)論：牛蒡子苷元可以促進(jìn)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡，可能是通過(guò)增強(qiáng)TNF-α、IL-2水平及上調(diào)Bax蛋白、下調(diào)Bcl-2、NF-кB蛋白水平而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

關(guān)鍵詞 牛蒡子苷元；C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

Abstract Objective：To investigate the inhibitory effect and apoptosis mechanism of arctigenin on C6 glioma cells. Methods：Arctigenin acted on C6 glioma cells. CCK-8 was used to detect the growth inhibition rate of each group； flow cytometry was used to detect apoptosis rate of different group； the levels of TNF-α and IL-2 were detected by ELISA； the expressions of Bax， Bcl-2 and NF-кb proteins were analyzed by Western blot. Results：Compared with the blank group， arctigenin （2.5～40 μmol/L） significantly inhibited the growth of C6 glioma cells and induced apoptosis of tumor cells in concentration-dependent； after treatment with arctigenin， the levels of TNF-α and IL-2 in the cells were increased； arctigenin could up-regulate the expression of Bax protein and down-regulate the expression of Bcl-2 and NF-кb Proteins. Conclusion：Arctigenin can promote the apoptosis of C6 glioma cells， which maybe through enhance the levels of TNF-α， IL-2 and up-regulated Bax protein， down-regulate Bcl-2 and NF-кb proteins levels.

Key Words Arctigenin； C6 glioma cell； Cell proliferation； Cell apoptosis

中圖分類號(hào)：R284文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.09.053

膠質(zhì)瘤（Glioma）是最常見(jiàn)的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，約占顱內(nèi)腫瘤的50%，其復(fù)發(fā)率和病死率極高[1]。膠質(zhì)瘤呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，手術(shù)難以完全根除，臨床上常用手術(shù)切除加以藥物化療，雖提高了治愈率，但腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物易產(chǎn)生耐藥性導(dǎo)致化療失敗，尋找新的治療方法是目前有效治療膠質(zhì)瘤亟需解決的問(wèn)題[2]。近年來(lái)中藥抗腫瘤成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。牛蒡子為菊科植物牛蒡（Arctium lappa L）的干燥成熟果實(shí)，牛蒡子苷元（Arctigenin，ARG）是牛蒡子中主要藥理活性成分，研究表明其具有抗炎[3]、抗免疫調(diào)節(jié)[4]、抗病毒[5]、抗腫瘤活性[6]。目前對(duì)于牛蒡子苷元體外抗膠質(zhì)瘤的研究較少，本實(shí)驗(yàn)探討牛蒡子苷元對(duì)體外C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和凋亡影響及機(jī)制，為臨床治療腦膠質(zhì)瘤提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系 C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2 試驗(yàn)藥物 牛蒡子苷元（ARG，Sigma公司）；牛蒡子苷元溶液：取牛蒡子苷元用含0.1%DMSO培養(yǎng)基溶解，稀釋制得40.00 μmol/L、20.00 μmol/L、10.00 μmol/L、5.00 μmol/L、2.50 μmol/L、1.25 μmol/L的溶液，儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 試劑與儀器 1）試劑：細(xì)胞增殖毒性檢測(cè)試劑盒CCK-8（廣州浩瑪生物科技有限公司）；膜聯(lián)蛋白V（Annexin-V）異硫氰酸熒光素（FITC）/碘化丙錠（PI）凋亡試劑盒（碧云天生物公司）；兔抗鼠NF-кB多克隆一抗、兔抗鼠Bax多克隆一抗、兔抗鼠Bcl-2多克隆一抗、兔抗鼠β-actin多克隆一抗，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）。2）儀器：多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)鉑金埃爾默公司）；ALTRA流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman Coulter公司）；ChemiDoc MP全能型凝膠成像分析系統(tǒng)（美國(guó)ABI公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組 共分空白組（0.1%DMSO培養(yǎng)基）、牛蒡子苷元不同濃度組（1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00 μmol/L），順鉑組（20 μmol/L），每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。

1.2.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率 各組加入相應(yīng)濃度的藥液100 μL，分別于給藥48 h后棄去藥液，加入含10% CCK-8的培養(yǎng)基100 μL，置于培養(yǎng)箱中孵育2 h后，于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其A值，計(jì)算藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值）×100%。

1.2.3 細(xì)胞周期分布與凋亡率檢測(cè) 用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，消化計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度5×104/mL，每孔2 mL接種于6孔板，培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)48 h棄去原培養(yǎng)液。按分組予以不同處理因素：空白組、牛蒡子苷元組（1.25 μmol/L）、牛蒡子苷元組（10 μmol/L）、牛蒡子苷元組（40 μmol/L）、順鉑組（20 μmol/L），每組5個(gè)復(fù)孔，每孔藥液2 mL藥物作用48 h后，用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，然后加入完全培養(yǎng)液終止消化，收集細(xì)胞，2 000 r/min×5 min離心，PBS洗兩遍，離心后棄上清液，按照凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書處理細(xì)胞，即每孔加入500 μL Binding Buffer重懸細(xì)胞，約為1×105細(xì)胞，加入5 μL的Annexinv/FITC，混勻后加入5 μL的PI染料，搖勻后避光孵育10 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，用Flowjo軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4 TNF-α、IL-2水平檢測(cè) 用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)。分組給藥處理后，收集細(xì)胞，-70 ℃保存，反復(fù)凍融3次使細(xì)胞完全破碎，3 000 r/min×10 min離心取上清液，按照TNF-α、IL-2檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作，每組5個(gè)復(fù)孔，450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其A值，計(jì)算TNF-α、IL-2水平。

1.2.5 Bax、Bcl-2、NF-кB蛋白表達(dá)檢測(cè) 用Western blot檢測(cè)。分組給藥處理后，每孔加入4 ℃冷PBS液1 mL沖洗2次，加入0.1 mL RIPA裂解液冰浴中充分裂解提取細(xì)胞總蛋白，-70 ℃保存?zhèn)溆?。按照BCA蛋白定量試劑盒對(duì)各組樣品進(jìn)行定量，每孔上樣80 μg蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行10% SDS-PAGE，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，TBST清洗，封閉1 h、分別加入Bax、Bcl-2、NF-кB、β-actin一抗（1∶2 000），4 ℃孵育過(guò)夜，室溫孵育二抗（1∶10 000）2 h，ECL化學(xué)發(fā)光，X線曝光顯影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次以上，數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 牛蒡子苷元抑制C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的量效和時(shí)效關(guān)系 牛蒡子苷元（1.25～40 μmol/L）作用于C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞后抑制率隨濃度增加而逐漸增強(qiáng)，呈現(xiàn)明顯的量-效關(guān)系，經(jīng)計(jì)算牛蒡子苷元對(duì)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度IC50為18.23 μmol/L。見(jiàn)表1。

2.2 牛蒡子苷元對(duì)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡率與周期分布的影響 各組細(xì)胞加藥培養(yǎng)48 h后，牛蒡子苷元處理組，G1/G0期所占細(xì)胞比例增多，除低濃度組（1.25 μmol/L）外，中濃度組（10 μmol/L）和高濃度組（40 μmol/L）與空白組比較顯著增多，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；空白組C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞自然凋亡率較低，經(jīng)牛蒡子苷元加藥處理后，凋亡率呈明顯上升趨勢(shì)，且呈濃度依賴趨勢(shì)。見(jiàn)表2。

2.3 牛蒡子苷元對(duì)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞TNF-α、IL-2水平的影響 與空白組比較，牛蒡子苷元處理組（10.00、40.00 μmol/L）均能顯著提高細(xì)胞中TNF-α、IL-2的水平；牛蒡子苷元低劑量組（1.25 μmol/L）中TNF-α、IL-2水平與空白組比較雖有增高趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表3。

2.4 牛蒡子苷元對(duì)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞Bax、Bcl-2、NF-кB蛋白表達(dá)水平的影響 與空白組比較，10、40 μmol/L牛蒡子苷元組C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)顯著增多，10.00、40.00 μmol/L牛蒡子苷元組C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Bcl-2、NF-кB蛋白表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表4。

3 討論

牛蒡子苷元作為牛蒡子中主要的藥理活性成分之一，研究表明牛蒡子苷元對(duì)膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)具有抑制作用[7]，此外還具有多種藥理活性，如抗糖尿病、抗白血病活性、心臟病調(diào)節(jié)等。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，牛蒡子苷元（2.5～40.00 μmol/L）對(duì)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有明顯的增殖抑制作用。與空白組比較，經(jīng)牛蒡子苷元處理后，使細(xì)胞大部分阻滯在G1/G0期，S期和G2/M期腫瘤細(xì)胞明顯減少，細(xì)胞凋亡率顯著增高，且呈濃度依賴關(guān)系。抑制率與凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，牛蒡子苷元可以抑制C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡。TNF-α、IL-2是機(jī)體內(nèi)重要的細(xì)胞因子。TNF-α可以直接殺死腫瘤細(xì)胞，抑制腫瘤細(xì)胞增殖并可以促進(jìn)凋亡[8]。IL-2可以增強(qiáng)T細(xì)胞的殺傷活性，發(fā)揮免疫功能[9]。牛蒡子苷元誘導(dǎo)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡，可能與增加細(xì)胞內(nèi)TNF-α、IL-2的水平有關(guān)，發(fā)揮其調(diào)節(jié)免疫功能。NF-кB是參與細(xì)胞凋亡的重要調(diào)控因子，其高表達(dá)是腫瘤產(chǎn)生耐藥性的重要原因[10]。Western blot結(jié)果顯示，牛蒡子苷元處理后，C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞中NF-кB蛋白顯著降低，促凋亡蛋白Bax表達(dá)顯著增加，抗凋亡蛋白Bcl顯著降低，可能是牛蒡子苷元誘導(dǎo)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一[11]。

本研究顯示，牛蒡子苷元能夠抑制C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示牛蒡子苷元可以提高C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞中TNF-α、IL-2水平，降低NF-кB、Bcl-2蛋白水平，提高Bax蛋白表達(dá)，抑制C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

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（2017-04-07收稿 責(zé)任編輯：楊覺(jué)雄）