曾玲芳 王億君 吳依辰 章慧
〔摘要〕 目的 觀察黃連素聯(lián)合順鉑對A549/DDP細胞凋亡的影響并探討其相關(guān)機制。方法 以A549/DDP細胞為研究對象,分別加入12 μg/mL的順鉑、濃度為20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L的黃連素+12 μg/mL的順鉑,設置空白對照孔(PBS孔),分別用藥物干預24 h、48 h、72 h,采用MTT法檢測細胞增殖活性;各組用藥干預48 h后,流式細胞儀檢測細胞凋亡,Western blot 法檢測Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2的蛋白表達情況,Real-time PCR法檢測Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2的mRNA表達水平。結(jié)果 黃連素聯(lián)合順鉑能夠抑制A549/DDP細胞增殖(P<0.01),并具有一定的時間-濃度依賴性。黃連素聯(lián)合順鉑能夠誘導耐藥細胞A549/DDP凋亡(P<0.01),且呈一定的濃度依賴性。不同濃度的黃連素聯(lián)合順鉑使促凋亡相關(guān)基因Caspase-3、Caspase-9、Bax在蛋白和mRNA水平表達上調(diào)(P<0.05),而抗凋亡基因Bcl-2在蛋白和mRNA水平表達下調(diào)(P<0.05)。結(jié)論 黃連素聯(lián)合順鉑抑制A549/DDP細胞增殖和促凋亡的分子機制可能是上調(diào)促凋亡相關(guān)基因Caspase-3、Caspase-9、Bax的表達,下調(diào)抗凋亡基因Bcl-2的表達。
〔關(guān)鍵詞〕 黃連素;順鉑;肺癌耐藥;細胞凋亡
〔中圖分類號〕R285.5;R734.2 〔文獻標志碼〕A 〔文章編號〕doi:10.3969/j.issn.1674-070X.2018.05.002
An Experimental Study on Apoptosis of A549 / DDP Cells Induced by Berberine
Combined with Cisplatin
ZENG Lingfang1, WANG Yijun1, WU Yichen1, ZHANG Hui2*
(1. Hunan University of Chinese Medicine, Changsha, Hunan 410208, China;
2. Hunan Cancer Hospital, Changsha, Hunan 410006, China)
〔Abstract〕 Objective To observe the effect of berberine combined with cisplatin on cell apoptosis of A549 / DDP and investgate its related mechanism. Methods Human lung cancer resistance A549 / DDP cells, as the object of study, were added with 12 μg/mL cisplatin, and 20 μmol/L, 40 μmol/L, 80 μmol/L berberine combined with 12 μg/mL cisplatin, respectively, blank control wells (PBS wells) were set up, they were all treated with drugs for 24 h, 48 h and 72 h. The cell proliferation was evaluated by MTT assay. After intervention with drugs for 48 h, cell apoptosis was determined by using the flow cytometry instrument. The protein and mRNA levels of Caspase-3, Caspase-9, Bax, Bcl-2 were measured by Real-time PCR and western blotting analysis, respectively. Results Berberine combined with cisplatin could inhibit the growth of A549 / DDP cells (P<0.01) and promote apoptosis of A549/DDP cells (P<0.01), with a certain time-concentration dependence. Different concentrations of berberine combined with cisplatin increased the levels of protein and mRNA levels of apoptosis genes Caspase-3, Caspase-9, Bax (P<0.05), and down-regulated the protein and mRNA levels of anti-apoptosis gene Bcl-2 (P<0.05). Conclusion The molecular mechanism of berberine combined with cisplatin in inhibiting proliferation and promoting apoptosis of A549 / DDP cells may be related to up-regulating the expression of apoptosis related proteins Caspase-3, Caspase-9 and Bax, downregulating the expression of anti-apoptosis protein Bcl-2.
〔Keywords〕 berberine; cisplatin; lung cancer drug resistance; cell apoptosis
肺癌是常見的惡性腫瘤之一,近年來其發(fā)病率和死亡率均明顯增高,據(jù)我國癌癥中心2017年發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示:2013年肺癌在我國惡性腫瘤的發(fā)病率及死亡率均位居榜首[1]。化療是肺癌綜合治療的重要手段之一,非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)占肺癌的80%以上,以鉑類為基礎的二藥聯(lián)合方案是目前公認的晚期NSCLC 的標準化療方案,但肺癌的一線化療有效率僅為20%~40%[2],二線化療有效率更低,其主要原因為肺癌對化療藥物極易產(chǎn)生耐藥性[3]。因此,肺癌耐藥已成為化療的“治療性瓶頸”,是肺癌臨床治療中的棘手問題[4]。黃連素,提取自中藥黃連、黃柏。黃連、黃柏,以其大苦大寒之性,最善攻毒、排毒、解毒,是一類運用廣泛的植物藥[5]。黃連素[6-13]在誘導食管癌、乳腺癌等其他腫瘤細胞凋亡方面已有相關(guān)報道,但尚未有關(guān)于黃連素誘導人肺癌耐藥A549/DDP細胞凋亡的相關(guān)研究。本實驗通過觀察黃連素聯(lián)合順鉑對A549/DDP細胞凋亡的影響并探討其相關(guān)機制,為黃連素能夠進一步應用于臨床,克服肺癌順鉑耐藥提供實驗依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 實驗對象
人肺癌耐藥細胞株A549/DDP購自中南大學腫瘤研究所;黃連素購于美國Sigma公司(批號:PHR1502);順鉑為山東齊魯醫(yī)藥股份有限公司產(chǎn)品(批號:H20023460)。
1.2 主要試劑
MTT粉(德國Serva公司),BCA蛋白定量試劑盒(美國Sigma公司);一抗caspase-3(英國abcam,Rabbit)、一抗caspase-9(美國proteitech,Rabbit);一抗bcl-2(美國santa cruz,Mouse)、一抗bax抗體(美國santa cruz,Rabbit);β-actin抗體(美國proteitech,Mouse);goat anti-mouse IgG、 goat anti-rabbit IgG(美國proteintech);顯影液(中國WellBiology);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas公司);PCR引物(南京金斯瑞公司)。
1.3 主要儀器
FACSCalibur流式細胞分析儀(BD公司)、DYCZ-40A轉(zhuǎn)膜儀(中國北京六一)、PIKO REAL 96熒光定量PCR儀(Thermo)、SPL0960熒光PCR板(Thermo)。
1.4 方法
1.4.1 實驗分組 (1)對照組:PBS組;(2)順鉑組:以12 mg/L的DDP處理;(3)低、中、高濃度黃連素+DDP組:濃度分別為20、40、80 μmol/L的黃連素+ 12 mg/L的DDP處理。
1.4.2 細胞培養(yǎng)及傳代 人肺癌耐藥細胞A549/DDP培養(yǎng)于含10%新生小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中,用 2 μg/mL順鉑維持其耐藥性,置于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng),2~3 d換液1次,細胞密度達80%左右,胰酶消化細胞,一分為二進行傳代。實驗前1周換成不含順鉑的培養(yǎng)基以減少順鉑對實驗的干擾。
1.4.3 MTT法檢測細胞增殖活性 取對數(shù)生長期細胞,胰蛋白酶消化,加入到RPMI-1640培養(yǎng)基吹打成單細胞懸液,以密度為1×104個細胞/孔接種于96 孔板內(nèi);采用12 mg/L的DDP、濃度為20、40、80 μmol/L的黃連素+12 mg/L的DDP作用于A549/DDP細胞24、48、72 h,每組均設4復孔;每孔加入MTT 20 μL繼續(xù)孵育4 h,吸棄上清,加入二甲基亞砜,充分震蕩混勻;用Bio-Tek酶標儀檢測各孔490 nm處吸光度值;計算細胞的生長抑制率:細胞生長抑制率=(1-實驗組/對照組)×100%。
1.4.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡 取各組藥物干預48 h的細胞,用不含EDTA的胰酶消化后,用含 12%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基吹打成單細胞懸液,吸取單細胞懸液至離心管中;PBS洗滌2次后以2 000 r/min離心5 min,收集約1×105~5×105細胞;加入500 μL的Binding buffer 懸浮細胞;加入5 μL Annexin V-FITC混勻后,加入5 μL Propidium Iodide,混勻;室溫、避光,反應5~15 min;1 h內(nèi),在流式細胞儀觀察檢測。
1.4.5 Western blot檢測蛋白表達 各組藥物干預48 h的細胞洗滌離心,加入RIPA裂解液提取樣品蛋白。按照BCA蛋白定量試劑盒使用說明操作,測定蛋白濃度。電泳后轉(zhuǎn)膜,將膜放置于脫脂牛奶中室溫1 h。將一抗按一定比例稀釋后(Bax、Bcl-2、Caspase-3均按1∶200稀釋,Caspase-9按1∶500稀釋)與膜孵育,孵育結(jié)束后用1×TBST洗3次。用HRP標記的二抗(稀釋比例1∶3 000)與膜孵育。最后以ECL顯色曝光,將曝光后的底片掃描,并用quantity one專業(yè)灰度分析軟件進行分析,并以β-actin作為內(nèi)參條帶。
1.4.6 RT-PCR檢測Caspase-3 mRNA、Caspase-9 mRNA、Bax mRNA、Bcl-2 mRNA的表達水平 Trizol提取細胞總RNA,紫外分光光度計測定RNA的濃度和純度。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA樣品完整性。按HiFiScript試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,逆轉(zhuǎn)錄反應條件為42 ℃孵育30~50 min,逆轉(zhuǎn)錄酶失活反應85 ℃孵育5 min。按SYBR實時熒光定量PCR法反應體系進行PCR反應。由南京金斯瑞合成PCR引物,序列如下:Caspase-3-F:5-GGTTCATCCAGTCGCTTTG-3;Caspase-3-R:5-TTCTGTTGCCACCTTTCG-3;product length:98 bp。Caspase-9-F:5-AAAGTTGTCGAAGCCAACCCTAG-3;Caspase-9-R:5-CAAATCCTCCAGAACCAATGTCC-3; product length:122 bp。Bcl-2-F:5-ATTGTGGCCTTCTTTGAGTTCG-3;Bcl-2-R:5-CCTACCCAGCCTCCGTTATCC-3;product length:152 bp。bax-F:5-CCAGGATGCGTCCACCAAGAA-3;bax-R:5-CCGTGTCCACGTCAGCAATCA-3;product length:104 bp。actin-F:5-CATCCTGCGTCTGGACCTGG-3;actin-R:5-TAATGTCACGCACGATTTCC-3product length:107 bp。每個實驗組設3個復孔,分別擴增Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2基因,得到3組△Ct,按照公式△Ct=目的△Ct-內(nèi)參△Ct,-ΔΔCt=(對照組)ΔCt平均值-各樣品ΔCt,2-ΔΔCt計算各樣品相對于對照組樣品目的基因的表達水平(本實驗以PBS樣為對照樣品)。
1.5 統(tǒng)計學方法
實驗所得數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)“x±s”表示,組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA),不滿足方差分析條件的則用Kruskal-Wallis H檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義,P<0.01為差異具有顯著統(tǒng)計學意義。
2 結(jié)果
2.1 MTT法檢測細胞增值
結(jié)果如表1所示:從中可以看出,作用24 h、48 h、72 h,與PBS組對比,低、中、高濃度黃連素聯(lián)合順鉑組、順鉑組對A549/DDP細胞增值抑制率差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01);隨著黃連素濃度增加,抑制率逐漸增高。
黃連素聯(lián)合順鉑能夠抑制A549/DDP細胞增殖,且有一定的時間和濃度依賴性。
2.2 流式細胞儀檢測細胞凋亡
結(jié)果如表2及圖1所示:順鉑組及低、中、高濃度黃連素聯(lián)合順鉑組細胞凋亡率均高于PBS組,并且差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01),但中濃度黃連素聯(lián)合順鉑組和高濃度黃連素聯(lián)合順鉑組兩組之間比較,細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
黃連素聯(lián)合順鉑能夠誘導耐藥細胞A549/DDP凋亡,且呈一定的濃度依賴性。
2.3 Western blot檢測蛋白表達
結(jié)果如圖2及表3所示:與PBS組相比,順鉑組,低、中、高濃度黃連素聯(lián)合順鉑組促凋亡相關(guān)蛋白Caspase3、Caspase9、Bax表達明顯增強(P<0.05),且低、中、高濃度黃連素聯(lián)合順鉑組與順鉑組之間比較也有統(tǒng)計學差異(P<0.05),隨著濃度增加,促凋亡相關(guān)蛋白Caspase3、Caspase9、Bax的表達呈上升趨勢;抗凋亡蛋白Bcl-2表達明顯減弱(P<0.05),且低、中、高濃度黃連素聯(lián)合順鉑組與順鉑組之間比較也有統(tǒng)計學差異(P<0.05),隨著濃度增加,抗凋亡蛋白Bcl-2的表達呈下降趨勢。
黃連素能夠增強A549/DDP細胞促凋亡相關(guān)蛋白Caspase3、Caspase9、Bax的表達,減弱抗凋亡蛋白Bcl-2的表達,并具有濃度依賴性。
2.4 RT-PCR法檢測Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2的mRNA水平
結(jié)果如表4所示:與PBS組相比,DDP組、低中高濃度黃連素聯(lián)合順鉑組促凋亡相關(guān)mRNA caspase-3、caspase-9、bax表達明顯上調(diào),有統(tǒng)計學差異(P<0.05),DDP組、低中高濃度黃連素聯(lián)合順鉑組抗凋亡mRNA bcl-2表達明顯下調(diào),有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。
黃連素聯(lián)合順鉑能夠增強caspase-3、caspase-9、bax的mRNA表達,減弱bcl-2的mRNA表達,并具有一定的濃度依賴性。
3 討論
腫瘤是細胞分裂與細胞死亡失衡的一類疾病,細胞凋亡障礙在惡性腫瘤細胞發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用。天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)是一組與細胞凋亡有關(guān)的蛋白酶,是細胞凋亡的中央處理器。Caspase家族分為三大類:凋亡啟動因子、凋亡執(zhí)行因子和炎癥介導因子,在細胞凋亡中構(gòu)成級聯(lián)放大效應。凋亡啟動因子位于級聯(lián)反應的上游,以caspase-9為代表,能在其它蛋白輔助下發(fā)生自我活化并識別和激活下游的caspase。凋亡執(zhí)行因子在級聯(lián)反應的下游,作用于其特異性底物并導致細胞凋亡。如Caspase-3,是caspase家族中的最重要的凋亡執(zhí)行者之一,是細胞凋亡過程中的主要效應因子,它的活化標志著凋亡進入了不可逆階段。不管是死亡受體介導的外源性凋亡途徑還是線粒體介導的內(nèi)源性凋亡途徑,Caspase-3和Caspase-9都發(fā)揮了作用,其中Caspase-3是外源性凋亡途徑和內(nèi)源性凋亡途徑的匯集點。
Bcl-2家族蛋白對細胞凋亡具有雙向調(diào)節(jié)作用,其作用部位主要是線粒體外膜,通過調(diào)節(jié)線粒體的膜孔隙形成蛋白[14],從而調(diào)節(jié)線粒體釋放促凋亡因子,參與線粒體介導的細胞凋亡過程。根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能不同分為兩類,一類是以Bcl-2為代表的抗凋亡蛋白,另一類是以Bax為代表的促凋亡蛋白。Bax蛋白能在較為廣泛的PH范圍內(nèi)形成孔道,允許一些離子和小分子如細胞色素c等穿過線粒體膜,進入細胞質(zhì),從而引起細胞凋亡,而Bcl-2蛋白的作用正好相反,它能封閉Bax蛋白形成孔道的活性,使一些小分子不能自由通過,從而保護細胞凋亡。近年來的研究認為Bcl-2蛋白可能是通過清除線粒體活性氧,抑制多種線粒體凋亡蛋白的釋放如細胞色素c釋放到細胞質(zhì),阻止Caspase的進一步激活,從而抑制細胞凋亡[15]。Bax蛋白是Bcl-2家族的前凋亡蛋白,一般存在于胞漿中,并作為一種細胞損傷和刺激的傳感器。當響應損傷和刺激時,Bax蛋白將重新定位于線粒體表面并破壞在正常狀態(tài)下抗凋亡的Bcl-2蛋白的功能。一般來說,在胞漿中的Bax以單體形式存在,然而在細胞發(fā)生凋亡時,與線粒體關(guān)聯(lián)的Bax既可能以無活性的單體形式存在,也可能以與線粒體膜結(jié)合的大分子量的活性復合物形式存在。Bax可以構(gòu)成跨線粒體外膜的孔,并促使膜電位的降低和細胞色素C(Cyt C)及凋亡誘導因子(AIF)的外流,細胞色素C與Apaf-1和ATP及Pro-Caspase-9形成復合物(凋亡體)并導致Caspase-9的激活。與細胞色素C的結(jié)合使Apaf-1與pro-Caspase-9的結(jié)合能力更強。
黃連素提取自黃連、黃柏,根據(jù)藥物功效確定的中醫(yī)歸經(jīng)理論中,均沒有關(guān)于黃連、黃柏入肺經(jīng)的記載。黃連入藥,除生用外,還有酒炙、姜汁炙、吳茱萸水炙等多種炮制方法,其功效各異。其中臨床上多用姜黃連清胃熱和胃止嘔,然酒黃連善清上焦火熱卻少有人知,更無謂于臨床使用。肺位居上焦,為五臟六腑之華蓋,肺為嬌臟,喜潤惡燥,結(jié)合其生理病理特點,可以將肺癌的病機概括為氣陰虧虛,瘀毒內(nèi)結(jié),黃連雖不入肺經(jīng),然酒黃連以其善清上焦火熱之功效而能夠治療肺癌,且現(xiàn)代藥理學研究已經(jīng)顯示黃連素具有誘導肺腺癌A549細胞凋亡的作用[16]。
實驗中我們采用不同濃度的黃連素聯(lián)合順鉑作用于A549/DDP細胞后,發(fā)現(xiàn)黃連素聯(lián)合順鉑能夠抑制人肺癌耐藥A549/DDP細胞增值,誘導細胞凋亡。在分子水平上進一步研究發(fā)現(xiàn),黃連素聯(lián)合順鉑能夠增強促凋亡因子Caspase-3、Caspase-9、Bax在mRNA和蛋白水平的表達,減弱抗凋亡因子Bcl-2在mRNA和蛋白水平的表達,由此我們可以推論黃連素聯(lián)合順鉑抑制A549/DDP細胞增殖和促凋亡的分子機制可能是上調(diào)促凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Caspase-9、Bax的表達,下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達。
參考文獻:
[1] 中國癌癥中心.2017年中國城市癌癥最新數(shù)據(jù)報告[EB/OL],2017-03-21.
[2] 孫彬栩,楊佩穎.非小細胞肺癌多藥耐藥機制及其逆轉(zhuǎn)的研究進展[J].疑難病雜志,2013,12(1):77-79.
[3] SAIKA K, SOBUE T. Cancer statistics in the world[J]. Gan To Kagaku Ryoho, 2013, 40(13):2475-2480.
[4] GALLUZZI L, SENOVILLA L, VITALE I, et al. Molecular mechanisms of cisplatin resistance[J]. Oncogene, 2012, 31(15):1869-1883.
[5] 左 茹,曹雪濱,張文生.黃連素藥理作用研究進展[J].環(huán)球中藥,2014,7(7):568-572.
[6] REFAAT A, ABDELHAMED S, YAGITA H, et al. Berberine enhances tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand-mediated apoptosis in breast cancer[J]. Oncol Lett, 2013, 6(3):840-844.
[7] YANG X, YANG B, CAI J, et al. Berberine enhances radiosensitivity of esophageal squamous cancer by targeting HIF-1α in vitro and in vivo[J]. Cancer Biol Ther, 2013,14(11):1068-1073.
[8] 郎 超,張立超,吉鵬宇,等.黃連素通過誘導腫瘤細胞內(nèi)GRP78膜轉(zhuǎn)位而促其凋亡[J].山西大學學報,2016,39(3):499-504.
[9] WANG C, WANG H, ZANG Y, et al. Berberine inhibits the proliferation of human nasopharyngeal carcinoma cells via an Epstein-Barr virus nuclear antigen 1-dependent mechanism[J].Oncology reports,2017,37(4):2109-2120.
[10] 曾智豪,陳小伍,朱達堅,等.鹽酸小檗堿對MCF-7乳腺癌小鼠體內(nèi)抑制腫瘤生長的實驗研究[J].河北醫(yī)學,2016,22(6):988-991.
[11] JIANG S X, QI B, YAO W J, et al. Berberine displays antitumor activity in esophageal cancer cells in vitro[J]. World journal of gastroenterology,2017,23(14):2511-2518.
[12] JIN H, JIN X, CAO B, et al.Berberine affects osteosarcoma via downregulating the caspase-1/IL-1β signaling axis[J].Oncology reports, 2017,37(2):729-736.
[13] 陳彬彬.黃連素對人結(jié)腸癌細胞凋亡和遷移作用的研究[D].廈門:廈門大學,2014.
[14] KORYTOWSKI W, BASOVA L V, PILAT A, et al. Permeabilization of the mitochondrial outer membrane by Bax/truncatedBid(tBid) proteins as sensitized by cardiolipin hydroperoxide translocation: mechanistic implications for the intrinsic pathway of oxidative apoptosis[J]. The Journal of biological chemistry,2011, 286(30):26334-26343.
[15] LIU C, HUANG Y, ZHANG Y, et al. Intracellular methylglyoxal induces oxidative damage to pancreatic beta cell line INS-1 cell through Ire1α-JNK and mitochondrial apoptotic pathway[J].Free radical research, 2017,51(4):337-350.
[16] 柯昌康,劉毓英,倪云峰,等.腺苷酸活化蛋白激酶在黃連素誘導人肺腺癌細胞凋亡中的作用機制[J].中華中醫(yī)藥雜志,2017,32(9):3977-3980.