胡慧鈺　劉姝妍

〔摘要〕 目的 研究 CCR5在三陰性乳腺癌（TNBC）中的表達(dá)以及其對(duì)患者生存預(yù)后的影響。方法 使用免疫組化方法檢測(cè)CCR5在62例三陰性乳腺癌癌組織標(biāo)本中的表達(dá)水平，繪制Kaplan-Meier曲線分析CCR5表達(dá)水平對(duì)患者生存預(yù)后的影響。結(jié)果 在62例臨床三陰性乳腺癌癌組織標(biāo)本中，29例樣本CCR5高表達(dá)，占樣本總數(shù)的46.77%；33例樣本CCR5低表達(dá)，占樣本總數(shù)的53.22%。5年生存分析：CCR5高表達(dá)與三陰性乳腺癌患者5年生存呈負(fù)相關(guān)（P=0.0031<0.05）。結(jié)論 CCR5在中國(guó)湖南地區(qū)乳腺癌患者癌組織樣本中均有表達(dá)，高表達(dá)CCR5提示患者預(yù)后較差，高表達(dá)CCR5可能促進(jìn)三陰性乳腺癌進(jìn)展及轉(zhuǎn)移。

〔關(guān)鍵詞〕 CCR5；CCL5；三陰性乳腺癌；5年生存

〔中圖分類號(hào)〕R737.9 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕B 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.05.018

CCR5 Expression in Triple-Negative Breast Cancer Tissue and Its Impact on 5 Year Survival

HU Huiyu1， LIU Shuyan2， BAN Yi3， LI Xin1*

（1. Department of Breast Surgery， Xiangya Hospital， Central South University， Changsha， Hunan 410008， China；

2. Department of Obstetrics and Gynecology， the Second Hospital of Jilin University， Changchun， Jilin 130000， China；

3. Weill Cornell Medicine， New York 10065， America）

〔Abstract〕 Objective To investigate the CCR5 expression in triple-negative breast cancer （TNBC） tissue， and its impact on survival prognosis. Methods The CCR5 expression in 62 specimens of TNBC were determined by immunochemical staining. Kaplan-Meier estimate was used to analyze the survival prognosis of TNBC patients. Results 29 cases， accounted for 46.77%， showed high expression of CCR5， and 33 cases， accounted for 53.22%， showed low expression of CCR5. High expression of CCR5 was negatively correlated with the 5-year-survival rates of these TNBC patients. Conclusion In the triple negative breast cancer patients in Hunan region of China， CCR5 is expressed. The high level expression of CCR5 indicated bad survival prognosis. CCL5/CCR5 may promote TNBC progression and metastasis.

〔Keywords〕 CCR5； CCL5； triple negative breast caner； 5-year-survival

三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer， TNBC）是被定義為缺乏雌激素受體（estrogen receptor， ER）、孕激素受體（progesterone receptor）以及人表皮生長(zhǎng)因子2（human epidermal growth factor receptor type 2，HER2）表達(dá)的亞型乳腺癌[1]，在所有乳腺癌病例中大約占15%[2]，具有侵襲性強(qiáng)、易復(fù)發(fā)、易轉(zhuǎn)移、生存期短和病死率高等特點(diǎn)[3-4]。三陰性乳腺癌因?yàn)槿狈τ行У氖荏w靶標(biāo)，臨床治療上現(xiàn)在除了傳統(tǒng)的化療藥物外，治療選擇受到極大限制。

趨化因子是生理上控制免疫細(xì)胞遷移的小分子量細(xì)胞因子，其功能通過與其同源的、屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族的膜受體相結(jié)合而實(shí)現(xiàn)。受體激活激發(fā)了一系列下游信號(hào)通路，從而導(dǎo)致細(xì)胞遷移。CCL5屬于CC趨化因子家族，其功能通過與其同源受體CCR5相結(jié)合而實(shí)現(xiàn)。CCL5主要表達(dá)于T細(xì)胞、血小板、巨噬細(xì)胞、管狀上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞以及某些特定的腫瘤細(xì)胞當(dāng)中[5-6]。一項(xiàng)基于TCGA以及METABRIC大數(shù)據(jù)樣本庫的研究顯示CCL5/CCR5特異性表達(dá)于三陰性乳腺癌樣本中[7]。有研究顯示，CCR5在基底樣乳腺癌（主要為三陰性乳腺癌）的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[8-10]。

本研究旨在探索CCR5在我國(guó)三陰性乳腺癌患者中的表達(dá)水平，并分析其生存預(yù)后差異，為尋求中國(guó)TNBC治療新靶點(diǎn)提供方向。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源

收集2010年10月至2013年3月間于湘雅醫(yī)院乳腺科行外科手術(shù)治療的三陰性乳腺癌臨床資料及手術(shù)病理樣本共62例。本實(shí)驗(yàn)通過湘雅醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理號(hào)：201308381。病人均簽署知情同意書。

1.2 方法及試劑

使用免疫組化方法檢測(cè)手術(shù)樣本中CCR5蛋白。脫蠟與染色：福爾馬林固定的三陰性乳腺癌組織白片依次浸泡于二甲苯、100%酒精、95%酒精、70%酒精、50%酒精、PBS液中?？贵w孵化：抗人CCR5抗體源自R&D systems，二抗為HRP-AEC免疫組化檢測(cè)試劑盒。最后蘇木精染色：CCR5顯色為紅至紅棕色，蘇木精顯色為藍(lán)色。

1.3 結(jié)果判斷

CCR5主要表達(dá)于癌組織內(nèi)浸潤(rùn)的中性粒細(xì)胞中，蘇木精染色后呈現(xiàn)出紅至紅棕色。定性分析：每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)高倍鏡視野（400倍），以細(xì)胞質(zhì)呈清晰紅棕色著色作為陽性表達(dá)細(xì)胞，記錄陽性細(xì)胞所占比例及染色強(qiáng)度。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：按陽性細(xì)胞數(shù)比例計(jì)0、1、2、3、4分，分別對(duì)應(yīng)無陽性細(xì)胞、≤25%、26%～50%、51%～75%、>75%。按陽性細(xì)胞著色程度分別記為0、1、2、3、4分，依次對(duì)應(yīng)無著色、淡紅色、紅色、紅棕色。上述兩種計(jì)分相加，取2名病理科醫(yī)師平均分值。1～3分判為CCR5低表達(dá)，4～8判為CCR5高表達(dá)。定量分析：將免疫組化染色切片在顯微鏡高倍鏡視野下定位后，彩色攝像機(jī)提取細(xì)胞圖像輸入Image-Pro Plus （IPP）圖像處理分析軟件，通過圖像分割，統(tǒng)計(jì)，獲得各病理切片細(xì)胞CCR5平均吸光光度值（u值）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用“x±s”表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用百分率（%）表示，采用？字2檢驗(yàn)；以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。生存分析Kaplan-Meier 5年生存曲線使用graphpad prism 6系統(tǒng)繪制完成。

2 結(jié)果

2.1 CCR5在三陰性乳腺癌中表達(dá)情況

CCR5主要表達(dá)于癌組織內(nèi)浸潤(rùn)的中性粒細(xì)胞中，在所有62例三陰性乳腺癌臨床癌組織樣本中，29例樣本CCR5高表達(dá)，占樣本總數(shù)的46.77%；33例樣本CCR5低表達(dá)，占樣本總數(shù)的53.23%。CCR5高、低水平表達(dá)兩組u值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002<0.05）。見圖1和表1。

2.2 三陰性乳腺癌患者不同表達(dá)水平CCR5與生存預(yù)后關(guān)系

對(duì)62例三陰性乳腺癌患者進(jìn)行隨訪，隨訪結(jié)果顯示CCR5高表達(dá)組5年生存率明顯低于CCR5低表達(dá)組（P=0.0031<0.05）。見圖2。

3 討論

三陰性乳腺癌具有平均發(fā)病年齡小、組織學(xué)分級(jí)高、侵襲性強(qiáng)、細(xì)胞增值率高、易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)，化療是三陰性乳腺癌目前唯一有效的全身綜合治療手段。有薈萃分析綜合了全球13份研究數(shù)據(jù)，包含3 087位患者以及3 735名對(duì)照成員，研究顯示CCL5及其受體CCR5高表達(dá)與乳腺癌易感性明顯相關(guān)，而與膀胱癌、宮頸癌、胰腺癌、前列腺癌以及頭頸部癌癥無明顯關(guān)系[11]。一項(xiàng)基于TCGA以及METABRIC大數(shù)據(jù)樣本庫的研究，在比較了Luminal A型、Luminal B型、Her 2陽性型及基底樣型乳腺癌各亞型中CCL5/CCR5表達(dá)水平后發(fā)現(xiàn)，CCL5/CCR5特異性表達(dá)于三陰性乳腺癌樣本中[7]。

在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移與遷徙過程中，腫瘤微環(huán)境一直扮演著重要角色，腫瘤微環(huán)境包含了腫瘤及其周圍細(xì)胞、血管、細(xì)胞外間質(zhì)、細(xì)胞因子以及細(xì)胞趨化因子[12]。CCL5（chemokine C-C motif ligand 5）， 又被稱之為RANTES （regulated upon activation， normal T-cell expressed and secreted），它是一個(gè)參與癌癥炎性進(jìn)程的重要細(xì)胞趨化因子。CCL5基因位于人類常染色體17q11.2-q12上，編碼的蛋白質(zhì)在許多生理過程中扮演重要角色[13]。CCL5介導(dǎo)了免疫細(xì)胞的遷移與趨化。研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中的CCL5主要來源于MSCs[14-15]。間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一種具有多向分化潛能的前體細(xì)胞，其在軟骨、骨、脂肪、肌肉等組織的再生中起重要作用[16]。研究中當(dāng)乳腺癌細(xì)胞與MSCs在體外共同培養(yǎng)時(shí)，MSCs將釋放大量CCL5[17]。而且，缺氧與CCL5可共同刺激乳腺癌細(xì)胞分泌CSF1（colony-stimulating factor 1），后者促使MSCs分泌更多的CCL5，從而形成正循環(huán)[18]。在此過程中，CSF1介導(dǎo)了腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrop

hages， TAMs）分泌表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF），從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[18]。有實(shí)驗(yàn)構(gòu)建CCL5過表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞系，并觀察到其細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力與侵襲性顯著增加，從而使得其在體內(nèi)經(jīng)由血管到達(dá)身體遠(yuǎn)處部位形成轉(zhuǎn)移灶能力顯著提高，證實(shí)了CCL5促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[17]。CCL5還通過促進(jìn)金屬蛋白酶（metalloproteinases，MMPs）的分泌，破壞細(xì)胞外間質(zhì)蛋白，加速腫瘤細(xì)胞的遷移[19-20]。動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)證實(shí)，與原發(fā)灶相比較，轉(zhuǎn)移灶癌細(xì)胞中CCR5表達(dá)陽性的乳腺癌細(xì)胞比例增加了8倍[21]。

在人三陰性乳腺癌細(xì)胞系（MDA-MB-231）中，也證實(shí)了CCL5可以促進(jìn)其增殖潛能[22]。人體實(shí)驗(yàn)表明，血漿CCL5濃度與TGF-β1正相關(guān)[23]，而CCL/CCR5復(fù)合體正是通過促進(jìn)T調(diào)節(jié)細(xì)胞分泌TGF-β來加速抗癌免疫細(xì)胞CD8+ T細(xì)胞的凋亡，從而加速癌癥進(jìn)程[24]，可以判斷CCR5陽性的乳腺癌細(xì)胞增殖侵襲能力更強(qiáng)。國(guó)內(nèi)鮮有研究報(bào)道中國(guó)南方三陰性乳腺癌患者中CCR5表達(dá)水平及其預(yù)后。本研究首次證實(shí)中國(guó)南方三陰性乳腺癌患者癌組織中CCR5表達(dá)水平，并發(fā)現(xiàn)高水平CCR5表達(dá)與患者預(yù)后呈負(fù)性相關(guān)。而既往體內(nèi)外研究也證明了CCL5/CCR5直接促進(jìn)乳腺癌進(jìn)展與轉(zhuǎn)移[21-24]。這項(xiàng)結(jié)論也同時(shí)可以解釋為何三陰性乳腺癌較其他類型乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)更高。

2014年，CCL5-CCR5復(fù)合體結(jié)構(gòu)被公諸于世[25]，這為抑制其功能從而降低乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)提供了新的方向。現(xiàn)在國(guó)際市場(chǎng)上已有針對(duì)于CCR5的單抗藥物Maraviroc應(yīng)用于抗HIV治療中[26]，并通過美國(guó)藥品食品管理局（US food and drug administration， FDA）批準(zhǔn)。已有臨床試驗(yàn)證實(shí)了maraviroc可以有效降低乳腺癌患者肺轉(zhuǎn)移癌的發(fā)生[26]。另有文獻(xiàn)報(bào)道，原花青素（procyanidins，PC）對(duì)三陰性乳腺癌也有一定抑制作用[27]，這也為中國(guó)乳腺癌患者尤其是三陰性乳腺癌患者的治療提供了新的方向。

參考文獻(xiàn)：

[1] FOULKES W D， SMITH I E， REIS-FILHO J S， Triple-negative breast cancer[J]. N Engl J Med， 2010，363（20）：1938-1948.

[2] REIS-FILHO J S. TUTT A N. Triple negative tumours： a critical review[J]. Histopathology， 2008， 52（1）：108-118.

[3] CAREY L， WINERE， VIALE G， et al. Triple-negative breast cancer： disease entity or title of convenience[J]. Nat Rev Clin Oncol， 2010，7（12）：683-692.

[4] MONTAGNA E， BAGNARDI V， ROTMENSZ N， et al. Outcome and Medial Presentation of Breast Cancer： European Institute of Oncology Experience[J]. Clin Breast Cancer， 2015，15（6）： 440-447.

[5] APPAY V， ROWLAND-JONES S L. RANTES： a versatile and controversial chemokine[J]. Trends in Immunology， 2001，22（2）： 83-87.

[6] LEVY J A. The unexpected pleiotropic activities of RANTES[J]. J Immunol， 2009，182（7）：3945-3946.

[7] FERTIG E J， LEE L， PANDEY N B， et al. Analysis of gene expression of secreted factors associated with breast cancer metastases in breast cancer subtypes[J]. Sci Rep， 2015，5：12133.

[8] MANES S， MIRA E， COLOMER R， et al. CCR5 expression influences the progression of human breast cancer in a p53-dependent manner[J]. J Exp Med， 2003，198（9）：1381-1389.

[9] MUROOKA T T， RAHBAR R， FISH E N. CCL5 promotes proliferation of MCF-7 cells through mTOR-dependent mRNA translation[J]. Biochem Biophys Res Commun， 2009，387（2）：381-386.

[10] VADAY G G， PEEHL D M， KADAM P A， et al. Expression of CCL5 （RANTES） and CCR5 in prostate cancer[J]. Prostate， 2006， 66（2）：124-134.

[11] LEE Y H， BAE S C， SONG G G. Association between the chemokine receptor 5 delta32 polymorphism and rheumatoid arthritis： a meta-analysis[J]. Mod Rheumatol， 2013，23（2）： 304-310.

[12] ALLINEN M， BEROUKHIM R， CAI L， et al. Molecular characterization of the tumor microenvironment in breast cancer[J]. Cancer Cell， 2004，6（1）： 17-32.

[13] DONLON T A， KRENSKY A M， WALLACE M R， et al. Localization of a human T-cell-specific gene， RANTES （D17S136E）， to chromosome 17q11.2-q12[J]. Genomics， 1990，6（3）： 548-553.

[14] JAYASINGHE M M， GOLDEN J M， NAER P， et al. Tumor-derived CCL5 does not contribute to breast cancer progression[J]. Breast Cancer Res Treat， 2008，111（3）：511-521.

[15] ZHANG Y， LV D， KIM H J， et al. A novel role of hematopoietic CCL5 in promoting triple-negative mammary tumor progression by regulating generation of myeloid-derived suppressor cells[J]. Cell Res， 2013， 23（3）： 394-408.

[16] PITTENGER M F， MACKAY A M， BECK S C， et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells[J]. Science， 1999，

284（5411）：143-147.

[17] KARNOUB A E， DASH A B， VO A P， et al. Mesenchymal stem cells within tumour stroma promote breast cancer metastasis[J]. Nature， 2007， 449（7162）： 557-563.

[18] CHATURVEDI P， GILKES D M， TAKANO N， et al. Hypoxia-inducible factor-dependent signaling between triple-negative breast cancer cells and mesenchymal stem cells promotes macrophage recruitment[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 2014，111（20）：2120-2129.

[19] SWAMYDAS M， RICCI K， REGO S L， et al. Mesenchymal stem cell-derived CCL-9 and CCL-5 promote mammary tumor cell invasion and the activation of matrix metalloproteinases[J]. Cell Adh Migr， 2013，7（3）： 315-324.

[20] YANG Y， WOLFRAM J， SHEN J， et al. Live-cell single-molecule imaging reveals clathrin and caveolin-1 dependent docking of SMAD4 at the cell membrane[J]. FEBS Lett， 2013，587（24）：3912-3920.

[21] VELASCO-VELAZQUEZ M， PESTELL R G. The CCL5/CCR5 axis promotes metastasis in basal breast cancer[J]. Oncoimmunology， 2013，2（4）：e23660.

[22] LIN S， WAN S， SUN L， et al. Chemokine C-C motif receptor 5 and C-C motif ligand 5 promote cancer cell migration under hypoxia[J]. Cancer Sci， 2012，103（5）： 904-912.

[23] HARTMANN M C， DWYER R M， COSTELLO M， et al. Relationship between CCL5 and transforming growth factor-beta1 （TGFbeta1） in breast cancer[J]. Eur J Cancer， 2011，47（11）： 1669-1675.

[24] CHANG L Y， LIN Y C， MAHALINGAM J， et al. Tumor-derived chemokine CCL5 enhances TGF-beta-mediated killing of CD8（+） T cells in colon cancer by T-regulatory cells[J]. Cancer Res， 2012，72（5）： 1092-1102.

[25] TAMAMIS P， FLOUDAS C A. FLOUDAS C A. Elucidating a key anti-HIV-1 and cancer-associated axis： the structure of CCL5 （Rantes） in complex with CCR5[J]. Sci Rep， 2014，4：5447.

[26] VELASCO-VELAZQUEZ M， JIAO X， FUENTE M， et al. CCR5 antagonist blocks metastasis of basal breast cancer cells[J]. Cancer Res， 2012，72（15）： 3839-3850.

[27] 黃秉一，徐朝軍，宋 嵐.原花青素促進(jìn)三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制研究[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，37（11）：1196-1199.