呂殷婷 焦舉 楊婷 鄒瓊 江淑琴 張勇
【摘要】目的從人前列腺癌DU145細(xì)胞中富集具有干細(xì)胞特性的腫瘤細(xì)胞,并鑒定其腫瘤干細(xì)胞特性。方法利用流式細(xì)胞儀比較人前列腺癌LNCaP細(xì)胞、DU145細(xì)胞中CD44+細(xì)胞所占比例;通過(guò)無(wú)血清連續(xù)傳代培養(yǎng),富集干性腫瘤細(xì)胞,計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)成球率;將無(wú)血清懸浮培養(yǎng)的腫瘤微球細(xì)胞,再次在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng),驗(yàn)證腫瘤干細(xì)胞的分化特性;利用CCK8增殖試驗(yàn)分別檢測(cè)DU145細(xì)胞和DU145腫瘤微球細(xì)胞,比較兩者增殖能力的差異;分別以DU145腫瘤微球細(xì)胞、DU145細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組制備荷瘤裸鼠模型,比較兩者體內(nèi)成瘤能力。結(jié)果流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示CD44+LNCaP、CD44+DU145比例分別為04%、976%。無(wú)血清懸浮培養(yǎng)DU145細(xì)胞第2日的成球率為(144±78)%,第7日的成球率為(342±87)%,第14日的成球率高達(dá)(614±76)%。懸浮成球DU145細(xì)胞在加入含10%胎牛血清培養(yǎng)基24h后,表現(xiàn)出和常規(guī)貼壁培養(yǎng)DU145細(xì)胞相同形態(tài)。DU145腫瘤微球細(xì)胞在鋪板后24h其增殖能力就可達(dá)到DU145細(xì)胞的2倍左右,在第6日之后,DU145腫瘤微球細(xì)胞存活率仍高于DU145細(xì)胞,組間450nm處吸光度比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<005)。與DU145細(xì)胞荷瘤裸鼠相比,DU145腫瘤微球細(xì)胞荷瘤裸鼠的移植瘤體積較大、生長(zhǎng)速度較快(P均<005)。結(jié)論無(wú)血清連續(xù)傳代培養(yǎng)的DU145細(xì)胞經(jīng)富集分離可得到具有干細(xì)胞特征的前列腺腫瘤細(xì)胞,該方法簡(jiǎn)便易行,具有較理想的應(yīng)用前景。
【關(guān)鍵詞】前列腺腫瘤干細(xì)胞;分化群44;無(wú)血清培養(yǎng);富集;鑒定
EnrichmentandidentificationofprostatecancerstemcellsfromDU145cellsLyuYinting,JiaoJu,YangTing,ZouQiong,JiangShuqin,ZhangYongDepartmentofNuclearMedicine,theThirdAffiliatedHospitalofSunYatsenUniversity,Guangzhou510630,China
Correspondingauthor,ZhangYong,Email:zy5040@163com
【Abstract】ObjectiveToenrichprostatecancerstemcellsfromhumanprostatecancerDU145celllineandidentifythecharacteristicsoftumorstemcellsMethodTheproportionofCD44+cellsinLNCaPandDU145cellswasdetectedbyflowcytometryThespheroidizationratesatdifferenttimepointswerecalculatedbyserumfreecontinuouscultureandenrichmentoftumorstemcellsThetumormicrospheresculturedintheserumfreeculturemediumweresubsequentlyculturedintheserumcontainingculturemediumtoverifythedifferentiationabilityoftumorstemcellsCCK8proliferationassaywasadoptedtomonitorandcomparetheproliferationabilitybetweenDU145cellsandDU145tumormicrospheresThetumorbearingnudemousemodelswereestablishedbyDU145cellsasthecontrolgroupandDU145tumormicrospheresastheexperimentalgroupThetumorigenicabilityinvivowasstatisticallycomparedbetweentwogroupsResultsFlowcytometrydemonstratedthattheproportionofCD44+LNCaPcellsandCD44+DU145cellswas04%and976%Afterculturedintheserumfreesuspension,thespheroidizationrateofDU145cellswas(144±78)%onthe2ndday,(342±87)%onthe7thdayand(614±76)%onthe14thday,respectivelyAfterculturedinthemediumcontaining10%fetalbovineserumfor24h,DU145tumormicrospheresshowedthesamemorphologyasDU145cellsTheproliferationabilityofDU145tumormicrosphereswasapproximatelytwiceashighasthatofDU145cellsduringthefirst24hOnthe6thday,thesurvivalrateofDU145tumormicrosphereswasstillhigherthanthatofDU145cellsTheabsorbancevaluesatthewavelengthof450nmsignificantlydifferedbetweentwogroups(allP<005)ComparedwithtumorbearingnudemousemodelsestablishedbyDU145cells,thetumorsizewassignificantlylargerandthegrowthratewasconsiderablyfasterinthemousemodelsbyDU145tumormicrospheres(bothP<005)ConclusionProstatecancerstemcellscanbeobtainedafterenrichmentandisolationbyserumfreecontinuouspassageofDU145cells,whichissimpleandfeasibleanddeservespromisingapplicationprospect
【Keywords】Prostatecancerstemcell;CD44;Serumfreeculture;Enrichment;Identification
前列腺癌是全球第二常見(jiàn)的男性惡性腫瘤[1]。雖然前列腺癌可以早期診斷及治療,但仍然是全世界男性癌癥死亡的第六大原因[2]。目前,針對(duì)前列腺癌治療的方式主要有手術(shù)切除、放射治療、內(nèi)分泌治療等幾大類[3]。然而,大多數(shù)前列腺癌在去勢(shì)手術(shù)治療后2年內(nèi)最終將轉(zhuǎn)化為去勢(shì)抵抗型前列腺癌,亦稱為難治性前列腺癌(CRPC)。近年來(lái),許多研究者提出了“前列腺腫瘤干細(xì)胞(PCSC)”的概念,認(rèn)為這可能是前列腺癌的細(xì)胞起源,并在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、去勢(shì)抵抗及耐藥等多個(gè)方面發(fā)揮作用[4]。腫瘤干細(xì)胞是腫瘤組織中具有無(wú)限自我更新能力并能產(chǎn)生腫瘤異質(zhì)性的細(xì)胞,其特性還包括具有分化潛能、高致瘤性等[5]。有研究發(fā)現(xiàn),從前列腺移植瘤中獲取的CD44+細(xì)胞具有干細(xì)胞特性。CD44是一種細(xì)胞表面分子,在細(xì)胞黏附、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、腫瘤遷移進(jìn)展等多方面有重要作用,也被公認(rèn)為是細(xì)胞具有干性傾向的分子標(biāo)志。本研究選取人前列腺癌DU145細(xì)胞進(jìn)行無(wú)血清連續(xù)傳代培養(yǎng),從而富集、分離腫瘤干細(xì)胞并鑒定其特性,以期利用一種簡(jiǎn)單、快捷、有效的方法實(shí)現(xiàn)前列腺腫瘤干細(xì)胞的制備,為后續(xù)更多針對(duì)前列腺癌干細(xì)胞靶向治療的研究奠定基礎(chǔ)。
材料與方法
一、材料
人前列腺癌LNCaP、DU145細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液(PBS)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。青霉素鏈霉素混合液、005%胰酶(含EDTA)、牛血清白蛋白(BSA)、胰島素、B27購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。人重組表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)購(gòu)于美國(guó)PeproTech公司。胰酶抑制劑購(gòu)自索萊寶公司。超低黏附6孔培養(yǎng)板購(gòu)自美國(guó)Corning公司。異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的鼠抗人CD44抗體及其同型抗體(IgG2b)、流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司。CCK8增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。550型酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Biorad公司。4~6周齡的NODSCID雄性裸鼠,體質(zhì)量18~20g,購(gòu)自北京維通利華公司,飼養(yǎng)于中山大學(xué)北校區(qū)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)動(dòng)物房,實(shí)驗(yàn)遵循動(dòng)物倫理要求。
二、方法
1細(xì)胞培養(yǎng)及傳代
將RPMI1640培養(yǎng)基加入10%胎牛血清和1%青霉素鏈霉素混合液制備成含血清培養(yǎng)基(SSM)。將體積分?jǐn)?shù)2%B27、04%BSA、5μg/ml胰島素、10ng/mlbFGF、20ng/mlEGF加入DMEM/F12培養(yǎng)基制備成無(wú)血清培養(yǎng)基(SFM)。DU145細(xì)胞在SSM中培養(yǎng)時(shí),每2d進(jìn)行細(xì)胞換液或傳代;在SFM中培養(yǎng)時(shí),每日觀察懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)情況并輕搖晃培養(yǎng)瓶避免細(xì)胞貼壁,每3d進(jìn)行細(xì)胞換液,每7d進(jìn)行細(xì)胞傳代。細(xì)胞傳代時(shí),棄舊培養(yǎng)基,加入1ml胰酶共孵育2min后,加入2ml胰酶抑制劑(或SSM)終止消化,后繼續(xù)按1∶2的比例傳代培養(yǎng),每日觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。
2LNCaP、DU145細(xì)胞中CD44+表達(dá)情況的檢測(cè)
取經(jīng)SSM培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LNCaP細(xì)胞和DU145細(xì)胞,分別以1×106個(gè)重懸于100μlPBS溶液中,2種細(xì)胞各制備3管,分別為空白管、同型對(duì)照管(含1μlIgG2b)、FITCCD44抗體管(含1μlFITCAntiCD44)避光4℃反應(yīng)15min后,加入1mlPBS,1000轉(zhuǎn)/分離心3min,輕倒掉上清液后加入400μlPBS重懸細(xì)胞,利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD44+細(xì)胞比例。
3DU145細(xì)胞無(wú)血清傳代培養(yǎng)富集腫瘤干細(xì)胞及成球率的計(jì)算
取經(jīng)SSM培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的DU145細(xì)胞,經(jīng)40μm孔徑細(xì)胞篩濾過(guò),用PBS離心清洗1次以去除血清后,以3×104個(gè)/孔重新鋪板于超低黏附6孔板中,加入SFM繼續(xù)在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14d。每日搖晃1次培養(yǎng)板避免細(xì)胞貼壁,每3d換1次液,分別于第20h、2d、7d、14d在倒置相差顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察。以形態(tài)立體、腫瘤細(xì)胞微球直徑>60μm定義為成球,連續(xù)計(jì)數(shù)5個(gè)視野取平均值計(jì)算成球率。成球率=該視野內(nèi)成球細(xì)胞個(gè)數(shù)/該視野內(nèi)總細(xì)胞個(gè)數(shù)×100%。
4SSM和SFM中檢測(cè)DU145腫瘤微球細(xì)胞的分化能力
將連續(xù)在SFM中培養(yǎng)14d后的DU145腫瘤微球細(xì)胞用胰酶消化分離后,用SSM終止反應(yīng),1000轉(zhuǎn)/分離心3min后棄上清液,加入新鮮SSM重懸細(xì)胞,于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),動(dòng)態(tài)觀察并記錄細(xì)胞形態(tài)變化情況。收集細(xì)胞,再次用500μl胰酶消化3min后用1ml胰酶抑制劑終止反應(yīng),離心后,用新鮮SFM重懸細(xì)胞并動(dòng)態(tài)觀察記錄細(xì)胞形態(tài)變化情況。
5DU145腫瘤微球細(xì)胞的體外增殖能力檢測(cè)
分別將DU145細(xì)胞、DU145腫瘤微球細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液,以103個(gè)/100μl的密度在96孔板中各接種3孔,使用SSM、37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每塊板設(shè)置3個(gè)含100μlSSM但不含細(xì)胞的的空白孔,以后每隔2d換液1次。第1~8日,每日于同一時(shí)間給一塊板加入10μlCCK8工作液后與細(xì)胞避光繼續(xù)在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)15h后,利用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處吸光度(OD450),并繪制細(xì)胞增殖曲線。
6檢測(cè)DU145腫瘤微球細(xì)胞在免疫缺陷裸鼠體內(nèi)的成瘤情況
DU145細(xì)胞(65×105/100μl)、DU145腫瘤微球細(xì)胞(65×104/100μl)分別消化、離心后以PBS重懸為上述密度單細(xì)胞懸液。將6只雄性NODSCID裸鼠稱重后隨機(jī)分為2組,每組3只。每只裸鼠注射100μl細(xì)胞懸液和100μl基質(zhì)膠混合液于左后腿根部皮下,動(dòng)態(tài)觀察2組裸鼠的成瘤情況,待肉眼可見(jiàn)腫瘤后,每5d用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑和短徑,計(jì)算腫瘤體積。腫瘤體積=(π×長(zhǎng)徑×短徑2/6)mm3,35d后處死裸鼠,并繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。
三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
應(yīng)用SPSS130處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以±s表示,組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<005為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
結(jié)果
一、LNCaP細(xì)胞、DU145細(xì)胞中CD44+細(xì)胞比例比較
CD44+LNCaP細(xì)胞、CD44+DU145細(xì)胞比例分別為04%、976%,見(jiàn)圖1。CD44+DU145細(xì)胞比例約為CD44+LNCaP細(xì)胞的271倍。
二、DU145細(xì)胞無(wú)血清連續(xù)傳代培養(yǎng)富集腫瘤干細(xì)胞及成球率
DU145細(xì)胞具有干細(xì)特征的部分可以在無(wú)血清培養(yǎng)基中生存并逐漸形成懸浮細(xì)胞球:懸浮培養(yǎng)20h時(shí),單個(gè)細(xì)胞開(kāi)始出芽,但尚未形成立體形態(tài);懸浮培養(yǎng)第2日可觀察到一小部分細(xì)胞表現(xiàn)出成球團(tuán)的趨勢(shì),成球率為(144±78)%;第7日可觀察到形態(tài)立體、典型的懸浮球形成,成球率為(342±87)%;懸浮培養(yǎng)第14日,成球率明顯較第7日增加,滿視野內(nèi)可觀察到立體形態(tài)的懸浮球,成球率為(614±76)%。并且DU145腫瘤微球細(xì)胞在經(jīng)過(guò)無(wú)血清懸浮培養(yǎng)傳代后,仍可形成與原細(xì)胞形態(tài)類似的次代并逐漸形成懸浮腫瘤微球細(xì)胞,見(jiàn)圖2。
三、DU145腫瘤微球細(xì)胞的分化能力
將無(wú)血清懸浮培養(yǎng)的DU145腫瘤微球細(xì)胞轉(zhuǎn)入含10%胎牛血清中培養(yǎng)10h,已能觀察到細(xì)胞貼壁,24h后其伸出偽足逐漸形成單層貼壁細(xì)胞,形態(tài)與常規(guī)貼壁培養(yǎng)DU145相近,見(jiàn)圖3。再次將其轉(zhuǎn)入無(wú)血清懸浮培養(yǎng),仍能在20h后觀察到單個(gè)細(xì)胞開(kāi)始出芽,形成一些懸浮細(xì)胞團(tuán),繼續(xù)培養(yǎng)至第5日,可觀察到典型腫瘤細(xì)胞球形成。
四、DU145腫瘤微球細(xì)胞的體外增殖能力
DU145腫瘤微球細(xì)胞與普通DU145細(xì)胞在鋪板后第2日的OD450分別為0757±0059、0373±0068,DU145腫瘤微球細(xì)胞增殖能力達(dá)到普通DU145細(xì)胞2倍左右(t=7382,P<005)。從第6日開(kāi)始,兩者皆進(jìn)入生長(zhǎng)平臺(tái)期。到第8日,DU145腫瘤微球細(xì)胞與普通DU145細(xì)胞的OD450分別為0228±0063、0086±0036,DU145腫瘤微球細(xì)胞存活量仍高于DU145細(xì)胞(t=3373,P<005),見(jiàn)圖4。
五、DU145腫瘤微球細(xì)胞在免疫缺陷裸鼠體內(nèi)的成瘤情況
DU145細(xì)胞組種植細(xì)胞的數(shù)量級(jí)是DU145腫瘤微球細(xì)胞組的10倍,但在移植瘤細(xì)胞接種裸鼠
圖1LNCaP細(xì)胞、DU145細(xì)胞中CD44+細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果
A、B:LNCaP細(xì)胞;C、D:DU145細(xì)胞
A:懸浮培養(yǎng)20h時(shí),單個(gè)細(xì)胞開(kāi)始出芽,但尚未形成立體形態(tài);B:懸浮培養(yǎng)第2日,可觀察到一小部分細(xì)胞表現(xiàn)出成球團(tuán)的趨勢(shì);C:懸浮培養(yǎng)第7日,可觀察到形態(tài)立體、典型的懸浮球形成;D:懸浮培養(yǎng)第14日,滿視野內(nèi)可觀察到立體形態(tài)的懸浮球;標(biāo)尺=60μm
細(xì)胞的體外增殖能力比較后第10日,DU145細(xì)胞組僅2只裸鼠可見(jiàn)皮下成瘤,瘤體體積(84±12)mm3,成瘤率2/3,而DU145腫瘤微球細(xì)胞組3只裸鼠均可見(jiàn)皮下腫瘤形成,瘤體體積(281±59)mm3,成瘤率為3/3,DU145腫瘤微球細(xì)胞組在第10日的瘤體體積大于DU145細(xì)胞組(t=4464,P<005)。接種后第30~35日為移植瘤快速生長(zhǎng)期,DU145細(xì)胞組生長(zhǎng)速度為(692±201)mm3/d,DU145腫瘤微球細(xì)胞組為(3763±451)mm3/d,DU145腫瘤微球細(xì)胞組生長(zhǎng)速度達(dá)到DU145細(xì)胞組的5倍(t=8709,P<005),見(jiàn)圖5A。DU145細(xì)胞與DU145腫瘤微球細(xì)胞移植瘤在裸鼠體內(nèi)生長(zhǎng)35d后活體情況見(jiàn)圖5B、C。
A:接種DU145細(xì)胞與DU145腫瘤微球細(xì)胞在免疫缺陷裸鼠體內(nèi)的移植瘤體積增長(zhǎng)曲線;B:DU145細(xì)胞在免疫缺陷裸鼠體內(nèi)35d生長(zhǎng)情況,紅色箭頭為裸鼠皮下成瘤處;C:DU145腫瘤微球細(xì)胞在免疫缺陷裸鼠體內(nèi)35d生長(zhǎng)情況討論
近年來(lái),研究者們已在多種腫瘤中分離并證實(shí)存在腫瘤干細(xì)胞[67]。在既往關(guān)于前列腺癌治療的相關(guān)報(bào)道中,基本是以前列腺癌細(xì)胞系為研究對(duì)象進(jìn)行體內(nèi)外研究。然而越來(lái)越多的研究表明,前列腺腫瘤干細(xì)胞才是前列腺癌發(fā)生、發(fā)展的根源。為此,本研究通過(guò)簡(jiǎn)單易行的無(wú)血清連續(xù)傳代培養(yǎng)法富集、分離前列腺腫瘤干細(xì)胞,并證明了其腫瘤干細(xì)胞相關(guān)特性,以期為針對(duì)前列腺腫瘤干細(xì)胞的診斷及治療研究奠定基礎(chǔ)。雖然,免疫磁珠分選法和流式分選法也是為研究者們所熟知的分選、富集腫瘤干細(xì)胞的另外2種常見(jiàn)方法。但是,這2種方法相較于本研究所使用的無(wú)血清連續(xù)傳代培養(yǎng)法,對(duì)科研設(shè)備要求更高,費(fèi)用也較為昂貴,例如利用免疫磁珠法分選CD44+DU145細(xì)胞需要合適的磁場(chǎng),以及同時(shí)制備大量的DU145細(xì)胞(108數(shù)量級(jí))進(jìn)行分選,對(duì)研究實(shí)驗(yàn)要求較高[8]。若利用流式分選法進(jìn)行CD44+DU145細(xì)胞分選,由于流式細(xì)胞儀分選通道較長(zhǎng)易造成細(xì)胞污染,且分選步驟復(fù)雜容易損傷細(xì)胞活性,分選得到的細(xì)胞難以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)[9]。
雖然既往研究顯示,CD44分子仍表達(dá)于結(jié)腸癌、頭頸部鱗癌、胃癌、膀胱癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、鼻咽癌等腫瘤細(xì)胞[1011]。但本研究選用的是CD44+人前列腺癌DU145細(xì)胞系,研究對(duì)象為前列腺癌,并通過(guò)無(wú)血清連續(xù)傳代培養(yǎng)的方式富集得到了具有干性特征的前列腺腫瘤細(xì)胞。因此,這與CD44不僅表達(dá)在前列腺腫瘤干細(xì)胞的特性并不沖突。
研究發(fā)現(xiàn),在人前列腺癌細(xì)胞株如LNCaP、DU145及PC3中,CD44+細(xì)胞比CD44-細(xì)胞有更強(qiáng)的增殖及成瘤的能力。Ugolkov等[12]指出,在前列腺癌組織中CD44+細(xì)胞約占72%,這一發(fā)現(xiàn)顛覆了以往干細(xì)胞僅占據(jù)組織細(xì)胞很小比例的認(rèn)識(shí)。本研究中,流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果示DU145細(xì)胞系中CD44+細(xì)胞約占976%,與Ugolkov等的觀點(diǎn)相符。
綜上所述,本研究通過(guò)對(duì)DU145細(xì)胞系連續(xù)傳代無(wú)血清培養(yǎng)富集、分離得到了具有干性特征的腫瘤細(xì)胞。這對(duì)于腫瘤干細(xì)胞這一類較難獲取細(xì)胞具有重要意義。同時(shí),本研究也對(duì)前列腺癌治療的相關(guān)研究,特別是對(duì)去勢(shì)難治性前列腺癌的治療提供了一種新的靶向治療思路,即針對(duì)前列腺腫瘤干細(xì)胞進(jìn)行靶向治療,從根源上治療前列腺癌。針對(duì)前列腺腫瘤干細(xì)胞的研究極具前景,本研究團(tuán)隊(duì)將以此研究為基礎(chǔ),今后繼續(xù)開(kāi)展針對(duì)前列腺腫瘤干細(xì)胞靶向診斷及治療的相關(guān)研究,進(jìn)而為前列腺癌的基礎(chǔ)研究提供一定的支持或參考。
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(收稿日期:20180320)