呂殷婷 焦舉 楊婷 鄒瓊 江淑琴 張勇

【摘要】目的從人前列腺癌DU145細(xì)胞中富集具有干細(xì)胞特性的腫瘤細(xì)胞，并鑒定其腫瘤干細(xì)胞特性。方法利用流式細(xì)胞儀比較人前列腺癌LNCaP細(xì)胞、DU145細(xì)胞中CD44+細(xì)胞所占比例；通過(guò)無(wú)血清連續(xù)傳代培養(yǎng)，富集干性腫瘤細(xì)胞，計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)成球率；將無(wú)血清懸浮培養(yǎng)的腫瘤微球細(xì)胞，再次在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，驗(yàn)證腫瘤干細(xì)胞的分化特性；利用CCK8增殖試驗(yàn)分別檢測(cè)DU145細(xì)胞和DU145腫瘤微球細(xì)胞，比較兩者增殖能力的差異；分別以DU145腫瘤微球細(xì)胞、DU145細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組制備荷瘤裸鼠模型，比較兩者體內(nèi)成瘤能力。結(jié)果流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示CD44+LNCaP、CD44+DU145比例分別為04%、976%。無(wú)血清懸浮培養(yǎng)DU145細(xì)胞第2日的成球率為（144±78）%，第7日的成球率為（342±87）%，第14日的成球率高達(dá)（614±76）%。懸浮成球DU145細(xì)胞在加入含10%胎牛血清培養(yǎng)基24h后，表現(xiàn)出和常規(guī)貼壁培養(yǎng)DU145細(xì)胞相同形態(tài)。DU145腫瘤微球細(xì)胞在鋪板后24h其增殖能力就可達(dá)到DU145細(xì)胞的2倍左右，在第6日之后，DU145腫瘤微球細(xì)胞存活率仍高于DU145細(xì)胞，組間450nm處吸光度比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均<005）。與DU145細(xì)胞荷瘤裸鼠相比，DU145腫瘤微球細(xì)胞荷瘤裸鼠的移植瘤體積較大、生長(zhǎng)速度較快（P均<005）。結(jié)論無(wú)血清連續(xù)傳代培養(yǎng)的DU145細(xì)胞經(jīng)富集分離可得到具有干細(xì)胞特征的前列腺腫瘤細(xì)胞，該方法簡(jiǎn)便易行，具有較理想的應(yīng)用前景。

【關(guān)鍵詞】前列腺腫瘤干細(xì)胞；分化群44；無(wú)血清培養(yǎng)；富集；鑒定

EnrichmentandidentificationofprostatecancerstemcellsfromDU145cellsLyuYinting，JiaoJu，YangTing，ZouQiong，JiangShuqin，ZhangYongDepartmentofNuclearMedicine，theThirdAffiliatedHospitalofSunYatsenUniversity，Guangzhou510630，China

Correspondingauthor，ZhangYong，Email：zy5040@163com

【Abstract】ObjectiveToenrichprostatecancerstemcellsfromhumanprostatecancerDU145celllineandidentifythecharacteristicsoftumorstemcellsMethodTheproportionofCD44+cellsinLNCaPandDU145cellswasdetectedbyflowcytometryThespheroidizationratesatdifferenttimepointswerecalculatedbyserumfreecontinuouscultureandenrichmentoftumorstemcellsThetumormicrospheresculturedintheserumfreeculturemediumweresubsequentlyculturedintheserumcontainingculturemediumtoverifythedifferentiationabilityoftumorstemcellsCCK8proliferationassaywasadoptedtomonitorandcomparetheproliferationabilitybetweenDU145cellsandDU145tumormicrospheresThetumorbearingnudemousemodelswereestablishedbyDU145cellsasthecontrolgroupandDU145tumormicrospheresastheexperimentalgroupThetumorigenicabilityinvivowasstatisticallycomparedbetweentwogroupsResultsFlowcytometrydemonstratedthattheproportionofCD44+LNCaPcellsandCD44+DU145cellswas04%and976%Afterculturedintheserumfreesuspension，thespheroidizationrateofDU145cellswas（144±78）%onthe2ndday，（342±87）%onthe7thdayand（614±76）%onthe14thday，respectivelyAfterculturedinthemediumcontaining10%fetalbovineserumfor24h，DU145tumormicrospheresshowedthesamemorphologyasDU145cellsTheproliferationabilityofDU145tumormicrosphereswasapproximatelytwiceashighasthatofDU145cellsduringthefirst24hOnthe6thday，thesurvivalrateofDU145tumormicrosphereswasstillhigherthanthatofDU145cellsTheabsorbancevaluesatthewavelengthof450nmsignificantlydifferedbetweentwogroups（allP<005）ComparedwithtumorbearingnudemousemodelsestablishedbyDU145cells，thetumorsizewassignificantlylargerandthegrowthratewasconsiderablyfasterinthemousemodelsbyDU145tumormicrospheres（bothP<005）ConclusionProstatecancerstemcellscanbeobtainedafterenrichmentandisolationbyserumfreecontinuouspassageofDU145cells，whichissimpleandfeasibleanddeservespromisingapplicationprospect

【Keywords】Prostatecancerstemcell；CD44；Serumfreeculture；Enrichment；Identification

前列腺癌是全球第二常見(jiàn)的男性惡性腫瘤[1]。雖然前列腺癌可以早期診斷及治療，但仍然是全世界男性癌癥死亡的第六大原因[2]。目前，針對(duì)前列腺癌治療的方式主要有手術(shù)切除、放射治療、內(nèi)分泌治療等幾大類[3]。然而，大多數(shù)前列腺癌在去勢(shì)手術(shù)治療后2年內(nèi)最終將轉(zhuǎn)化為去勢(shì)抵抗型前列腺癌，亦稱為難治性前列腺癌（CRPC）。近年來(lái)，許多研究者提出了“前列腺腫瘤干細(xì)胞（PCSC）”的概念，認(rèn)為這可能是前列腺癌的細(xì)胞起源，并在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、去勢(shì)抵抗及耐藥等多個(gè)方面發(fā)揮作用[4]。腫瘤干細(xì)胞是腫瘤組織中具有無(wú)限自我更新能力并能產(chǎn)生腫瘤異質(zhì)性的細(xì)胞，其特性還包括具有分化潛能、高致瘤性等[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，從前列腺移植瘤中獲取的CD44+細(xì)胞具有干細(xì)胞特性。CD44是一種細(xì)胞表面分子，在細(xì)胞黏附、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、腫瘤遷移進(jìn)展等多方面有重要作用，也被公認(rèn)為是細(xì)胞具有干性傾向的分子標(biāo)志。本研究選取人前列腺癌DU145細(xì)胞進(jìn)行無(wú)血清連續(xù)傳代培養(yǎng)，從而富集、分離腫瘤干細(xì)胞并鑒定其特性，以期利用一種簡(jiǎn)單、快捷、有效的方法實(shí)現(xiàn)前列腺腫瘤干細(xì)胞的制備，為后續(xù)更多針對(duì)前列腺癌干細(xì)胞靶向治療的研究奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

一、材料

人前列腺癌LNCaP、DU145細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液（PBS）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。青霉素鏈霉素混合液、005%胰酶（含EDTA）、牛血清白蛋白（BSA）、胰島素、B27購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。人重組表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）購(gòu)于美國(guó)PeproTech公司。胰酶抑制劑購(gòu)自索萊寶公司。超低黏附6孔培養(yǎng)板購(gòu)自美國(guó)Corning公司。異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的鼠抗人CD44抗體及其同型抗體（IgG2b）、流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司。CCK8增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。550型酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Biorad公司。4～6周齡的NODSCID雄性裸鼠，體質(zhì)量18～20g，購(gòu)自北京維通利華公司，飼養(yǎng)于中山大學(xué)北校區(qū)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)動(dòng)物房，實(shí)驗(yàn)遵循動(dòng)物倫理要求。

二、方法

1細(xì)胞培養(yǎng)及傳代

將RPMI1640培養(yǎng)基加入10%胎牛血清和1%青霉素鏈霉素混合液制備成含血清培養(yǎng)基（SSM）。將體積分?jǐn)?shù)2%B27、04%BSA、5μg/ml胰島素、10ng/mlbFGF、20ng/mlEGF加入DMEM/F12培養(yǎng)基制備成無(wú)血清培養(yǎng)基（SFM）。DU145細(xì)胞在SSM中培養(yǎng)時(shí)，每2d進(jìn)行細(xì)胞換液或傳代；在SFM中培養(yǎng)時(shí)，每日觀察懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)情況并輕搖晃培養(yǎng)瓶避免細(xì)胞貼壁，每3d進(jìn)行細(xì)胞換液，每7d進(jìn)行細(xì)胞傳代。細(xì)胞傳代時(shí)，棄舊培養(yǎng)基，加入1ml胰酶共孵育2min后，加入2ml胰酶抑制劑（或SSM）終止消化，后繼續(xù)按1∶2的比例傳代培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。

2LNCaP、DU145細(xì)胞中CD44+表達(dá)情況的檢測(cè)

取經(jīng)SSM培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LNCaP細(xì)胞和DU145細(xì)胞，分別以1×106個(gè)重懸于100μlPBS溶液中，2種細(xì)胞各制備3管，分別為空白管、同型對(duì)照管（含1μlIgG2b）、FITCCD44抗體管（含1μlFITCAntiCD44）避光4℃反應(yīng)15min后，加入1mlPBS，1000轉(zhuǎn)/分離心3min，輕倒掉上清液后加入400μlPBS重懸細(xì)胞，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD44+細(xì)胞比例。

3DU145細(xì)胞無(wú)血清傳代培養(yǎng)富集腫瘤干細(xì)胞及成球率的計(jì)算

取經(jīng)SSM培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的DU145細(xì)胞，經(jīng)40μm孔徑細(xì)胞篩濾過(guò)，用PBS離心清洗1次以去除血清后，以3×104個(gè)/孔重新鋪板于超低黏附6孔板中，加入SFM繼續(xù)在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14d。每日搖晃1次培養(yǎng)板避免細(xì)胞貼壁，每3d換1次液，分別于第20h、2d、7d、14d在倒置相差顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察。以形態(tài)立體、腫瘤細(xì)胞微球直徑>60μm定義為成球，連續(xù)計(jì)數(shù)5個(gè)視野取平均值計(jì)算成球率。成球率=該視野內(nèi)成球細(xì)胞個(gè)數(shù)/該視野內(nèi)總細(xì)胞個(gè)數(shù)×100%。

4SSM和SFM中檢測(cè)DU145腫瘤微球細(xì)胞的分化能力

將連續(xù)在SFM中培養(yǎng)14d后的DU145腫瘤微球細(xì)胞用胰酶消化分離后，用SSM終止反應(yīng)，1000轉(zhuǎn)/分離心3min后棄上清液，加入新鮮SSM重懸細(xì)胞，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，動(dòng)態(tài)觀察并記錄細(xì)胞形態(tài)變化情況。收集細(xì)胞，再次用500μl胰酶消化3min后用1ml胰酶抑制劑終止反應(yīng)，離心后，用新鮮SFM重懸細(xì)胞并動(dòng)態(tài)觀察記錄細(xì)胞形態(tài)變化情況。

5DU145腫瘤微球細(xì)胞的體外增殖能力檢測(cè)

分別將DU145細(xì)胞、DU145腫瘤微球細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，以103個(gè)/100μl的密度在96孔板中各接種3孔，使用SSM、37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每塊板設(shè)置3個(gè)含100μlSSM但不含細(xì)胞的的空白孔，以后每隔2d換液1次。第1～8日，每日于同一時(shí)間給一塊板加入10μlCCK8工作液后與細(xì)胞避光繼續(xù)在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)15h后，利用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處吸光度（OD450），并繪制細(xì)胞增殖曲線。

6檢測(cè)DU145腫瘤微球細(xì)胞在免疫缺陷裸鼠體內(nèi)的成瘤情況

DU145細(xì)胞（65×105/100μl）、DU145腫瘤微球細(xì)胞（65×104/100μl）分別消化、離心后以PBS重懸為上述密度單細(xì)胞懸液。將6只雄性NODSCID裸鼠稱重后隨機(jī)分為2組，每組3只。每只裸鼠注射100μl細(xì)胞懸液和100μl基質(zhì)膠混合液于左后腿根部皮下，動(dòng)態(tài)觀察2組裸鼠的成瘤情況，待肉眼可見(jiàn)腫瘤后，每5d用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑和短徑，計(jì)算腫瘤體積。腫瘤體積=（π×長(zhǎng)徑×短徑2/6）mm3，35d后處死裸鼠，并繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS130處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<005為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、LNCaP細(xì)胞、DU145細(xì)胞中CD44+細(xì)胞比例比較

CD44+LNCaP細(xì)胞、CD44+DU145細(xì)胞比例分別為04%、976%，見(jiàn)圖1。CD44+DU145細(xì)胞比例約為CD44+LNCaP細(xì)胞的271倍。

二、DU145細(xì)胞無(wú)血清連續(xù)傳代培養(yǎng)富集腫瘤干細(xì)胞及成球率

DU145細(xì)胞具有干細(xì)特征的部分可以在無(wú)血清培養(yǎng)基中生存并逐漸形成懸浮細(xì)胞球：懸浮培養(yǎng)20h時(shí)，單個(gè)細(xì)胞開(kāi)始出芽，但尚未形成立體形態(tài)；懸浮培養(yǎng)第2日可觀察到一小部分細(xì)胞表現(xiàn)出成球團(tuán)的趨勢(shì)，成球率為（144±78）%；第7日可觀察到形態(tài)立體、典型的懸浮球形成，成球率為（342±87）%；懸浮培養(yǎng)第14日，成球率明顯較第7日增加，滿視野內(nèi)可觀察到立體形態(tài)的懸浮球，成球率為（614±76）%。并且DU145腫瘤微球細(xì)胞在經(jīng)過(guò)無(wú)血清懸浮培養(yǎng)傳代后，仍可形成與原細(xì)胞形態(tài)類似的次代并逐漸形成懸浮腫瘤微球細(xì)胞，見(jiàn)圖2。

三、DU145腫瘤微球細(xì)胞的分化能力

將無(wú)血清懸浮培養(yǎng)的DU145腫瘤微球細(xì)胞轉(zhuǎn)入含10%胎牛血清中培養(yǎng)10h，已能觀察到細(xì)胞貼壁，24h后其伸出偽足逐漸形成單層貼壁細(xì)胞，形態(tài)與常規(guī)貼壁培養(yǎng)DU145相近，見(jiàn)圖3。再次將其轉(zhuǎn)入無(wú)血清懸浮培養(yǎng)，仍能在20h后觀察到單個(gè)細(xì)胞開(kāi)始出芽，形成一些懸浮細(xì)胞團(tuán)，繼續(xù)培養(yǎng)至第5日，可觀察到典型腫瘤細(xì)胞球形成。

四、DU145腫瘤微球細(xì)胞的體外增殖能力

DU145腫瘤微球細(xì)胞與普通DU145細(xì)胞在鋪板后第2日的OD450分別為0757±0059、0373±0068，DU145腫瘤微球細(xì)胞增殖能力達(dá)到普通DU145細(xì)胞2倍左右（t=7382，P<005）。從第6日開(kāi)始，兩者皆進(jìn)入生長(zhǎng)平臺(tái)期。到第8日，DU145腫瘤微球細(xì)胞與普通DU145細(xì)胞的OD450分別為0228±0063、0086±0036，DU145腫瘤微球細(xì)胞存活量仍高于DU145細(xì)胞（t=3373，P<005），見(jiàn)圖4。

五、DU145腫瘤微球細(xì)胞在免疫缺陷裸鼠體內(nèi)的成瘤情況

DU145細(xì)胞組種植細(xì)胞的數(shù)量級(jí)是DU145腫瘤微球細(xì)胞組的10倍，但在移植瘤細(xì)胞接種裸鼠

圖1LNCaP細(xì)胞、DU145細(xì)胞中CD44+細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果

A、B：LNCaP細(xì)胞；C、D：DU145細(xì)胞

A：懸浮培養(yǎng)20h時(shí)，單個(gè)細(xì)胞開(kāi)始出芽，但尚未形成立體形態(tài)；B：懸浮培養(yǎng)第2日，可觀察到一小部分細(xì)胞表現(xiàn)出成球團(tuán)的趨勢(shì)；C：懸浮培養(yǎng)第7日，可觀察到形態(tài)立體、典型的懸浮球形成；D：懸浮培養(yǎng)第14日，滿視野內(nèi)可觀察到立體形態(tài)的懸浮球；標(biāo)尺=60μm

細(xì)胞的體外增殖能力比較后第10日，DU145細(xì)胞組僅2只裸鼠可見(jiàn)皮下成瘤，瘤體體積（84±12）mm3，成瘤率2/3，而DU145腫瘤微球細(xì)胞組3只裸鼠均可見(jiàn)皮下腫瘤形成，瘤體體積（281±59）mm3，成瘤率為3/3，DU145腫瘤微球細(xì)胞組在第10日的瘤體體積大于DU145細(xì)胞組（t=4464，P<005）。接種后第30～35日為移植瘤快速生長(zhǎng)期，DU145細(xì)胞組生長(zhǎng)速度為（692±201）mm3/d，DU145腫瘤微球細(xì)胞組為（3763±451）mm3/d，DU145腫瘤微球細(xì)胞組生長(zhǎng)速度達(dá)到DU145細(xì)胞組的5倍（t=8709，P<005），見(jiàn)圖5A。DU145細(xì)胞與DU145腫瘤微球細(xì)胞移植瘤在裸鼠體內(nèi)生長(zhǎng)35d后活體情況見(jiàn)圖5B、C。

A：接種DU145細(xì)胞與DU145腫瘤微球細(xì)胞在免疫缺陷裸鼠體內(nèi)的移植瘤體積增長(zhǎng)曲線；B：DU145細(xì)胞在免疫缺陷裸鼠體內(nèi)35d生長(zhǎng)情況，紅色箭頭為裸鼠皮下成瘤處；C：DU145腫瘤微球細(xì)胞在免疫缺陷裸鼠體內(nèi)35d生長(zhǎng)情況討論

近年來(lái)，研究者們已在多種腫瘤中分離并證實(shí)存在腫瘤干細(xì)胞[67]。在既往關(guān)于前列腺癌治療的相關(guān)報(bào)道中，基本是以前列腺癌細(xì)胞系為研究對(duì)象進(jìn)行體內(nèi)外研究。然而越來(lái)越多的研究表明，前列腺腫瘤干細(xì)胞才是前列腺癌發(fā)生、發(fā)展的根源。為此，本研究通過(guò)簡(jiǎn)單易行的無(wú)血清連續(xù)傳代培養(yǎng)法富集、分離前列腺腫瘤干細(xì)胞，并證明了其腫瘤干細(xì)胞相關(guān)特性，以期為針對(duì)前列腺腫瘤干細(xì)胞的診斷及治療研究奠定基礎(chǔ)。雖然，免疫磁珠分選法和流式分選法也是為研究者們所熟知的分選、富集腫瘤干細(xì)胞的另外2種常見(jiàn)方法。但是，這2種方法相較于本研究所使用的無(wú)血清連續(xù)傳代培養(yǎng)法，對(duì)科研設(shè)備要求更高，費(fèi)用也較為昂貴，例如利用免疫磁珠法分選CD44+DU145細(xì)胞需要合適的磁場(chǎng)，以及同時(shí)制備大量的DU145細(xì)胞（108數(shù)量級(jí)）進(jìn)行分選，對(duì)研究實(shí)驗(yàn)要求較高[8]。若利用流式分選法進(jìn)行CD44+DU145細(xì)胞分選，由于流式細(xì)胞儀分選通道較長(zhǎng)易造成細(xì)胞污染，且分選步驟復(fù)雜容易損傷細(xì)胞活性，分選得到的細(xì)胞難以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)[9]。

雖然既往研究顯示，CD44分子仍表達(dá)于結(jié)腸癌、頭頸部鱗癌、胃癌、膀胱癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、鼻咽癌等腫瘤細(xì)胞[1011]。但本研究選用的是CD44+人前列腺癌DU145細(xì)胞系，研究對(duì)象為前列腺癌，并通過(guò)無(wú)血清連續(xù)傳代培養(yǎng)的方式富集得到了具有干性特征的前列腺腫瘤細(xì)胞。因此，這與CD44不僅表達(dá)在前列腺腫瘤干細(xì)胞的特性并不沖突。

研究發(fā)現(xiàn)，在人前列腺癌細(xì)胞株如LNCaP、DU145及PC3中，CD44+細(xì)胞比CD44-細(xì)胞有更強(qiáng)的增殖及成瘤的能力。Ugolkov等[12]指出，在前列腺癌組織中CD44+細(xì)胞約占72%，這一發(fā)現(xiàn)顛覆了以往干細(xì)胞僅占據(jù)組織細(xì)胞很小比例的認(rèn)識(shí)。本研究中，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果示DU145細(xì)胞系中CD44+細(xì)胞約占976%，與Ugolkov等的觀點(diǎn)相符。

綜上所述，本研究通過(guò)對(duì)DU145細(xì)胞系連續(xù)傳代無(wú)血清培養(yǎng)富集、分離得到了具有干性特征的腫瘤細(xì)胞。這對(duì)于腫瘤干細(xì)胞這一類較難獲取細(xì)胞具有重要意義。同時(shí)，本研究也對(duì)前列腺癌治療的相關(guān)研究，特別是對(duì)去勢(shì)難治性前列腺癌的治療提供了一種新的靶向治療思路，即針對(duì)前列腺腫瘤干細(xì)胞進(jìn)行靶向治療，從根源上治療前列腺癌。針對(duì)前列腺腫瘤干細(xì)胞的研究極具前景，本研究團(tuán)隊(duì)將以此研究為基礎(chǔ)，今后繼續(xù)開(kāi)展針對(duì)前列腺腫瘤干細(xì)胞靶向診斷及治療的相關(guān)研究，進(jìn)而為前列腺癌的基礎(chǔ)研究提供一定的支持或參考。

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（收稿日期：20180320）