陳健明 陳勝棣 黃綺云 孔衛(wèi)乾

【摘要】目的探討手足口病患兒的腸道病毒核酸轉(zhuǎn)陰時間，尋找手足口病的傳播規(guī)律。 方法 收集臨床確診手足口病患兒，采集患兒的咽拭子、唾液及糞便樣本，采用熒光定量PCR技術(shù)篩選出腸道病毒71（EV71）、柯薩奇病毒A組16型（CoxA16）核酸陽性的58例患兒，隨后根據(jù)病毒類型及疾病嚴(yán)重程度，將研究對象分為EV71輕癥組、EV71重癥組、CoxA16輕癥組、CoxA16重癥組，分析4組患兒3種樣本的腸道病毒核酸轉(zhuǎn)陰情況。 結(jié)果58例手足患兒中， EV71陽性38例（66%），CoxA16陽性20例（34%）。EV71陽性者中，輕癥20例、重癥18例；CoxA16陽性者中，輕癥11例、重癥9例。EV71患兒的糞便樣本最長排毒時間為63 d，CoxA16患兒的糞便樣本最長排毒時間為42 d。EV71及CoxA16重癥組患兒的糞便樣本在起病后的腸道病毒核酸轉(zhuǎn)陰時間均長于同組的咽拭子和唾液樣本（P均<005）。EV71及CoxA16輕癥組的糞便、咽拭子、唾液樣本腸道病毒核酸轉(zhuǎn)陰時間均短于重癥組對應(yīng)的樣本（P均<005）。結(jié)論手足口病患兒排毒時間與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)，病情越嚴(yán)重其排毒時間越長。疾病早期應(yīng)采集3類樣本同時進(jìn)行檢測，疾病后期應(yīng)重點對糞便樣本進(jìn)行檢測。

【關(guān)鍵詞】手足口?。谎适米樱煌僖?；糞便；病毒核酸；轉(zhuǎn)陰時間

Study of negativeconversion time of enterovirus nucleic acids in children with handfootmouth disease Chen Jianming， Chen Shengdi， Huang Qiyun， Kong Weiqian Department of Pediatrics， Panyu Central Hospital， Guangzhou 511400， China

Corresponding author，Chen Jianming， Email：13662378012@163com

【Abstract】ObjectiveTo explore the time of negative conversion of enterovirus nucleic acids in children with handfootmouth disease and to investigate the transmission pattern of handfootmouth disease（HFMD） MethodsFiftyeight children clinically diagnosed with HFMD were enrolled Throat swabs， saliva and fecal samples collected from all participants were positive for enterovirus 71 （EV71） orcoxsackievirus A16 （CoxA16） by fluorescent quantitative PCR According to the virus type and disease severity， all patients were divided into mild EV71， severe EV71， mild CoxA16 and severe CoxA16 groups The negative conversion of enterovirus nucleic acids in three types of samples was analyzed among four groups ResultsIn 58 children with HFMD， 38 cases （66%） were positive for EV71 （including 20 mild and 18 severe EV71） and 20 （34%） positive for CoxA16 （including 11 mild and 9 severe CoxA16） The longest time of virus shedding in the fecal samples from EV71infected children was 63 d， and 42 d for those infected with CoxA16 For children with severe EV71 and CoxA16， the time of negative conversion of enterovirus nucleic acids in the fecal samples was significantly longer than that in the throat swabs and saliva samples （both P<005） For children with mild EV71 and CoxA16， the time of negative conversion of enterovirus nucleic acids in the fecal， throat swabs and saliva samples was significantly shorter than that in their counterparts with severe EV71 and CoxA16 （all P<005） ConclusionsThe time of virus shedding is correlated with the disease severity in children with handfootmouth disease The time of virus shedding is prolonged in children with more serious disease Three types of samples should be collected during the early stage of handfootmouth disease， whereas the fecal samples should be emphasized in the advanced stage of the disease

【Key words】Handfootmouth disease； Throat swabs； Saliva； Feccal； Viral nucleic acid；

Negativeconversion time

手足口病是一種由腸道病毒感染所引起的具有傳染性的疾病，其主要的病原體包括腸道病毒71型（EV71）和柯薩奇病毒A16型（CoxA16），好發(fā)于5歲以下的兒童[12]。重癥病例可并發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥、心肌炎、神經(jīng)源性肺水腫等，早期臨床癥狀不典型、病情常突然急轉(zhuǎn)直下，往往在發(fā)病早期突然出現(xiàn)預(yù)后不良的情況，并因此引發(fā)醫(yī)患矛盾[3]。對手足口病患兒實施隔離可切斷手足口病的傳染源，是防止手足口病流行的重要措施，而患兒的排泄物中病毒的排毒時間是制定隔離期的重要參考。熒光定量PCR技術(shù)是檢測手足口病腸道病毒的有效手段[4]。本研究對手足口病患兒不同來源樣本的病毒核酸存在時間進(jìn)行比較，并分析不同病情、不同病原體患兒持續(xù)排毒時間的差異，探討手足口病的傳播規(guī)律，現(xiàn)報告如下。

對象與方法

一、研究對象

2017年1～12月在我院兒科就診的80例手足口病患兒中，臨床診斷符合2010年國家衛(wèi)生部制定的《手足口病診療指南（2010年版）》標(biāo)準(zhǔn)[5]。選擇經(jīng)實時定量PCR技術(shù)檢出咽拭子、糞便和唾液中任一樣本的EV71或CoxA16病毒核酸陽性共58例患兒納入研究。58例手足口病患兒男30例、女28例，年齡1～13歲、中位年齡3歲，其中6～11月齡7例、1～2歲28例、3～5歲21例、6～13歲2例，5歲以下患兒占97%；來源于托幼機(jī)構(gòu)49例（85%），有明確手足口病患兒接觸史41例（71%）。發(fā)病月份1～3月9例（16%）、4～6月30例（52%）、7～9月15例（26%）、10～12月4例（7%）。排除標(biāo)準(zhǔn)：①家長不合作或失訪的患兒；②確診患有嚴(yán)重免疫缺陷的患兒；③首診時病毒核酸樣本檢測陰性的患兒。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，入組患兒的監(jiān)護(hù)人均已簽署知情同意書。

二、診斷標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)2010年國家衛(wèi)生部制定的《手足口病診療指南（2010年版）》標(biāo)準(zhǔn)，重癥病例指神經(jīng)系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)或呼吸系統(tǒng)受累，并出現(xiàn)下列情況之一者：①精神差、嗜睡、易驚、肢體抖動，無力或急性弛緩性麻痹；②呼吸困難、紫紺、血性泡沫痰；③低血壓、肢端循環(huán)不良等。無重癥表現(xiàn)的患兒歸入普通病例。

三、方法

1分組

58例患兒根據(jù)病原體及病情分為4組：EV71重癥組、EV71輕癥組、CoxA16重癥組、CoxA16輕癥組。4組患兒的性別構(gòu)成、年齡比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均>005）。

2樣本收集

收集手足口病臨床確診患兒的咽拭子、糞便和唾液樣本，從起病當(dāng)日進(jìn)行樣本采集，之后按起病后第7日、第14日……的順序每隔7日采集1次樣本，樣本病毒核酸檢測轉(zhuǎn)為陰性的時間記錄為病毒核酸轉(zhuǎn)陰時間。其中咽拭子及唾液樣本的采集均在上午8～10時進(jìn)行，采集前2 h無進(jìn)食或刷牙，咽拭子采集時讓患兒張口，以咽后壁發(fā)紅部位的中心及上下，以棉簽各按壓3次，棉簽放于滅菌管，樣本加入2 ml病毒保護(hù)液，-20℃保存；唾液采集時讓患兒在安靜狀態(tài)下口含3根棉簽并停留2 min，棉簽放回唾液采集管，標(biāo)本分別加入2 ml病毒保護(hù)液（含100 U/ml青霉素，100 U/ml鏈霉素，2 000 U/ml兩性霉素B），4 ℃暫存，12 h內(nèi)送達(dá)實驗室，-20℃保存。患兒排大便后立即取糞便樣本，置于無菌管內(nèi)待測。收集樣本后，所有樣本均在48 h內(nèi)完成實驗室檢測工作。

3主要試劑及儀器

儀器包括德國Eppendorf 5415D型臺式離心機(jī)、羅氏480 PCR儀、美國Cary50Probe紫外光度計。試劑包括臺灣Geneaid EV71和CoxA16 RNA檢測試劑盒，上海輝睿手足口腸道病毒RNA檢測（熒光PCR法）試劑盒。陽性質(zhì)控品為滅活的腸道病毒，陰性質(zhì)控品為生理鹽水。

4實驗室檢測

經(jīng)前處理的樣本，選用EV71和CoxA16 RNA檢測試劑盒進(jìn)行核酸提取，提取后使用手足口腸道病毒RNA檢測試劑盒，在PCR儀上進(jìn)行EV71、CoxA16病毒核酸檢測。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 190對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。不符合正態(tài)分布的定量資料采用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示，2組間比較用Wilcoxon秩和檢驗，組內(nèi)不同樣本間比較采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計資料的秩和檢驗；計數(shù)資料采用百分比表示，組間比較采用χ2檢驗。P<005為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、58例手足口病患兒的病情分組及腸道病毒檢出情況

首診時檢測出EV71或CoxA16病毒核酸陽性的58例患兒中， EV71陽性38例（66%），CoxA16陽性20例（34%）。EV71陽性者中，輕癥20例、重癥18例；CoxA16陽性者中，輕癥11例、重癥9例。其首診糞便、咽拭子、唾液樣本的病毒核酸陽性率組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均>005），見表1。

二、不同病情及病原體手足口病患兒的腸道病毒核酸轉(zhuǎn)陰時間分析

各組隨著時間的延長，病毒核酸的轉(zhuǎn)陰率呈上升趨勢。EV71輕癥患兒約75%在起病后14 d病毒檢測轉(zhuǎn)陰，35 d全部樣本病毒檢測轉(zhuǎn)陰。EV71重癥病例起病14 d內(nèi)病毒核酸檢測均陽性，至49 d大部分（89%）患兒轉(zhuǎn)為陰性，至63 d全部重癥病例轉(zhuǎn)為陰性。CoxA16輕癥組約有半數(shù)（55%）患兒起病7 d內(nèi)病毒檢測轉(zhuǎn)陰，至28 d全部轉(zhuǎn)陰。CoxA16重癥病例起病后的14 d內(nèi)僅有1例病毒核酸檢測轉(zhuǎn)陰性，起病35 d后大部分（8/9）患兒轉(zhuǎn)為陰性，至42 d后全部轉(zhuǎn)為陰性，見表2。

三、不同樣本的腸道病毒核酸檢測情況比較

1EV71的檢出情況比較

EV71重癥組患兒的糞便樣本在起病后的病毒核酸轉(zhuǎn)陰時間長于同組的咽拭子和唾液樣本（P<005）。EV71輕癥組的糞便、咽拭子、唾液3類樣本分別與重癥組對應(yīng)的糞便、咽拭子、唾液樣本進(jìn)行比較，其核酸轉(zhuǎn)陰的時間均較短（P均<005）。EV71輕癥組的糞便、咽拭子、唾液3類樣本的轉(zhuǎn)陰時間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>005），見表3。

CoxA16重癥組患兒的糞便樣本在起病后的病毒核酸轉(zhuǎn)陰時間長于同組的咽拭子和唾液樣本（P<005）。CoxA16輕癥組的糞便、咽拭子、唾液3類樣本分別與重癥組對應(yīng)的糞便、咽拭子、唾液樣本進(jìn)行比較，其核酸轉(zhuǎn)陰的時間均較短（P均<005）。CoxA16輕癥組的糞便、咽拭子、唾液3類樣本的轉(zhuǎn)陰時間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>005），見表4。

討論

我國全年均有發(fā)生手足口病的的報道，發(fā)病率達(dá)37/100 000～205/100 000，病死率也較高，且近年來其發(fā)病率有逐步增長的趨勢。手足口病是一種由腸道病毒引起的傳染病，引起手足口病的腸道病毒可達(dá)20多種，其中以EV71和CoxA16最為常表4CoxA16輕癥組與重癥組不同樣本間的病毒核酸轉(zhuǎn)陰時間比較[中位數(shù)（四分位數(shù)間距）]d組別例數(shù)糞便咽拭子唾液χ2值P值CoxA16輕癥組1170（70）70（70）70（18）15400463CoxA16重癥組921（140）140（105）140（70）68680032Z值-3137-2898-3346P值000100040001見。手足口病的主要臨床表現(xiàn)為發(fā)熱（以低熱為主），手、足、口腔等部位出現(xiàn)小皰疹或小潰瘍[23，6]。手足口病具有自限性，臨床癥狀大多數(shù)在7 d左右自愈，也有少數(shù)患者出現(xiàn)心肌炎、肺水腫、無菌性腦膜腦炎等嚴(yán)重并發(fā)癥，甚至可導(dǎo)致死亡[7]。手足口病能通過糞口途徑、呼吸道飛沫等途徑傳播。2008年手足口病納入國家丙類傳染病管理，2012年有超過200萬例手足口病患者[8]。手足口病常發(fā)生在學(xué)齡前兒童，嬰幼兒尤為多見。當(dāng)處于手足口病流行季節(jié)，周圍兒童有手足口病流行，在發(fā)病前曾與手足口病患兒有直接或間接接觸史，且出現(xiàn)發(fā)熱，手、足、口腔等部位出現(xiàn)小皰疹等臨床表現(xiàn)，臨床診斷為手足口病。在臨床診斷手足口病的基礎(chǔ)上，具有以下3項的任意一項即可確診手足口?。孩貱oxA16、EV71等腸道病毒特異性核酸陽性；②分離出腸道病毒，并鑒定為CoxA16、EV71等可導(dǎo)致手足口病的腸道病毒；③急性期與恢復(fù)期血清相關(guān)腸道病毒的中和抗體有4倍及以上升高[5]。目前對手足口病病原體無特效藥治療，一般是對癥支持治療。針對手足口病的EV71疫苗已經(jīng)在我國上市，但對傳染源進(jìn)行隔離仍然是防止手足口病流行的工作重點[9]。研究并明確不同類型手足口病患兒的排毒時間規(guī)律，對防治手足口病有重要意義。

本研究中，EV71及CoxA16輕癥組的病毒核酸轉(zhuǎn)陰時間均短于重癥組，提示手足口病患兒的病毒核酸轉(zhuǎn)陰時間與疾病嚴(yán)重程度密切相關(guān)，這與Li等[10]及滕淑等[11]的研究結(jié)果一致。本研究對不同病原體進(jìn)行比較，結(jié)果顯示EV71重癥組的病毒核酸轉(zhuǎn)陰時間也長于CoxA16重癥組，其最長的病毒核酸轉(zhuǎn)陰時間可達(dá)63 d。在起病14 d后，大多數(shù)患兒的臨床癥狀已經(jīng)消失，但仍有部分患兒存在經(jīng)糞便持續(xù)排毒的情況，仍可能造成疾病的傳播，提示有癥狀的患兒和無癥狀的康復(fù)患兒均可能是傳染源，與常樹麗等[12]的報道相一致。重癥患兒癥狀緩解后出院回家，如長期排出帶病毒的排泄物，則會成為病毒的傳染源，有可能導(dǎo)致所在社區(qū)、學(xué)校的手足口病流行。因此，建議手足口病患兒至少隔離2～4周，重癥病例的隔離時間可適當(dāng)延長，此外還要注意手足口病患兒分泌物及排泄物的處理，盡可能切斷糞口、呼吸道飛沫等的傳播途徑。

腸道病毒侵入人體后，首先與宿主黏膜上皮細(xì)胞膜蛋白受體結(jié)合，植入細(xì)胞并脫去衣殼，釋放RNA基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄、復(fù)制和增殖，隨后經(jīng)淋巴通道逐步轉(zhuǎn)移到局部淋巴組織（如口腔唾液腺體、扁桃體和腸道集合淋巴結(jié)）增殖[1314]。理論上隨著病程的發(fā)展，不同器官的樣本病毒檢測會有差異[1516]。本研究對3類樣本的檢測結(jié)果進(jìn)行對比分析，EV71感染患兒在首診時糞便、咽拭子、唾液樣本的陽性率均較高，隨著時間的延長其檢測陽性率逐步下降，起病42 d全部咽拭子、唾液樣本的病毒核酸已轉(zhuǎn)陰，仍有4例患兒在糞便中檢測到病毒核酸。對CoxA16患兒樣本進(jìn)行檢測也有類似情況，起病28 d全部咽拭子、唾液樣本的病毒核酸已轉(zhuǎn)陰，仍有3例患兒在糞便中檢測到病毒核酸。因此，建議在疾病早期對可疑病例采集多種樣本同時進(jìn)行檢測，提高病毒核酸檢出率，避免漏診；在疾病排毒期應(yīng)重點對患兒糞便樣本進(jìn)行采集檢驗，能提高檢出率，對手足口病的防控有一定意義。

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