黃霜 甘釗杏 蔣瑋瑩 陳素琴

【摘要】目的鑒定一個常染色體顯性β地中海貧血（β地貧）家系的致病性突變。方法調(diào)查一個常染色體顯性β地貧家系的血液學(xué)及臨床資料，提取外周血DNA并進(jìn)行分子遺傳學(xué)分析。并在PubMed數(shù)據(jù)庫、人類血紅蛋白變異和地中海貧血數(shù)據(jù)庫（HbVar數(shù)據(jù)庫）、人類基因突變數(shù)據(jù)庫（HGMD數(shù)據(jù)庫）、中國生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)服務(wù)系統(tǒng)（SinoMed）、中國期刊全文數(shù)據(jù)庫（CNKI）、萬方數(shù)據(jù)知識服務(wù)平臺和維普中文科技期刊數(shù)據(jù)庫檢索攜帶血紅蛋白Dippie突變患者的資料進(jìn)行分析。結(jié)果 該家系共4例患者，所有患者HBB基因的第127密碼子均發(fā)生c383 A>G[beta127（H5）Gln>Arg]）雜合性突變，該變異即血紅蛋白Dippie突變，導(dǎo)致患者出現(xiàn)典型的類中間型β地貧表型。β珠蛋白基因單倍型分析顯示，c383G突變與單倍型2 [+ +]連鎖。4例患者血紅蛋白F表達(dá)水平相關(guān)的主要SNPs位點(diǎn)基因型均為HBG2 rs7482144 G/G（XmmI： ）、HBS1LMYB rs9399137 T/T和 BCL11A rs766432 A/A。4例患者均無KLF1基因的功能性變異。檢索文獻(xiàn)后共收集到3例攜帶血紅蛋白Dieppe雜合性突變患者的資料，其中僅1例法國籍患者具有較詳細(xì)的血液學(xué)表型資料，其癥狀亦為類中間型地貧癥狀。結(jié)論該常染色體顯性β地貧家系的致病性突變?yōu)閏383 A>G[beta127（H5）Gln>Arg]）雜合性突變。此變異導(dǎo)致該家系患者出現(xiàn)典型的類中間型β地貧表型。

【關(guān)鍵詞】β地中海貧血；常染色體顯性；血紅蛋白Dippie；中國人

Molecular genetic analysis of a Chinese pedigree with dominantly inherited βthalassaemiaHuang Shuang， Gan Zhaoxing， Jiang Weiying， Chen Suqin Department of Laboratory， Panyu Hexian Memorial Hospital， Guangzhou 510530， China

Corresponding author，Chen Suqin， Email： chensq@mailsysueducn

【Abstract】ObjectiveTo identify the pathogenic mutation in a Chinese pedigree with dominantly inherited βthalassemia （βthalassemia） MethodsThe hematological and clinical data of a Chinese pedigree with βthalassemia were investigated DNA was extracted from the peripheral blood for molecular genetic analysis Clinical data of patients carrying hemoglobin Dippie （Hb Dippie） mutation were retrieved from PubMed， HbVar， HGMD， SinoMed， CNKI， Wanfang data and Chongqing Vip databases ResultsNucleotide sequencing of HBB gene revealed the heterozygosity for codon 127 （c383A>G [beta127 （H5） Gln>Arg]） in all four patients within this family This mutation， namely Hb Dippie， resulted in the phenotype of typical βthalassemia intermedia The βglobin haplotype demonstrated that c383G mutation was linked to the haplotype 2[+ +] For four patients， the genotypes of HbFassociated SNPs mainly consisted of rs7482144 G/G （XmmI： ） in HBG2， rs9399137 T/T in HBS1LMYB， rs766432 A/A in BCL11A No functional mutation of KLF1 gene was observed After literature retrieval， clinical data of three patients with Hb Dippie mutation were collected Among them， relatively complete hematological and phenotypic data were obtained in only one French patient， who was diagnosed with βthalassemia intermedia ConclusionsThe pathogenic mutation of the dominantly inherited βthalassemia is c383 A>G [beta127 （H5） Gln>Arg] heterogeneous mutation， which leads to typical phenotype of βthalassemia intermedia in this family

【Key words】βthalassemia； Autosomal dominance； Hemoglobin Dippie； Chinese

β地中海貧血（β地貧， MIM 613985）是由于β珠蛋白基因突變導(dǎo)致β珠蛋白肽鏈合成量減少或完全不合成而引起的慢性溶血性貧血，是我國南方常見的危害人民健康的單基因遺傳病之一[1]。β地貧通常被認(rèn)為是一種常染色體隱性遺傳性疾病，因?yàn)榛颊咧挥型瑫r獲得2個突變等位基因（突變的純合子或雙重雜合子）而造成β珠蛋白肽鏈合成量嚴(yán)重減少時才會出現(xiàn)明顯的臨床癥狀。顯性遺傳性β地貧（dominantly inherited βthalassaemia）是其中罕見的一種類型，通常是由于β珠蛋白結(jié)構(gòu)變異導(dǎo)致不穩(wěn)定的異常血紅蛋白沉積在細(xì)胞內(nèi)引起的[2]。該病也曾被稱為“包涵體性β地貧”（inclusion body βthalassaemia），其表型多為嚴(yán)重程度不等的類中間型β地貧[3]。自1973年該病的首個家系（愛爾蘭）被報道以來，全世界已發(fā)現(xiàn)超過40種突變可引起顯性遺傳性β地貧[4]。中國國內(nèi)包括臺灣地區(qū)，迄今為止僅有幾篇關(guān)于中國人顯性遺傳性β地貧的報道[57]。在本研究中，筆者對一個常染色體顯性β地貧家系進(jìn)行了相關(guān)基因突變的分析，并復(fù)習(xí)了相關(guān)文獻(xiàn)，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

對象與方法

一、1例表現(xiàn)為“貧血”的常染色體顯性β地貧患者及其家系成員臨床資料的收集

廣州市番禺區(qū)何賢紀(jì)念醫(yī)院于2012年4月診治1例表現(xiàn)為“貧血”的常染色體顯性β地貧女性患者，收集并分析該例患者（先證者）及其家系成員的病史、體格檢查、實(shí)驗(yàn)室及輔助檢查、治療等資料。

二、基因型及各項(xiàng)血液學(xué)參數(shù)的檢測

為了進(jìn)一步明確病因，該例患者及其家系成員于2017年在中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院遺傳教研室接受遺傳學(xué)分析及相關(guān)檢測。檢測內(nèi)容包括患者及其家系成員的基因型及各項(xiàng)血液學(xué)參數(shù)，包括α、β珠蛋白基因、β珠蛋白基因單倍型、血紅蛋白F表達(dá)水平相關(guān)的主要SNPs的基因型和KLF1基因序列、血紅蛋白組分、紅細(xì)胞參數(shù)。本研究經(jīng)患者及其家系成員知情同意，并經(jīng)中山大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1基因組DNA的提取

取患者及其家系成員的外周血2 ml，按常規(guī)酚、氯仿、異戊醇抽提法進(jìn)行基因組DNA的提取。

2血紅蛋白水平及紅細(xì)胞參數(shù)

采用全自動血液分析儀（XE2100， Sysmex， Kobe，日本）檢測患者及家庭成員的血紅蛋白水平及紅細(xì)胞參數(shù)。

3血紅蛋白組分分析

采用Helena SPIFE 3000（Helena Laboratory， Beaumont， TX，美國）檢測患者及其家系成員的血紅蛋白組分，包括血紅蛋白A（α2β2）、 血紅蛋白A2（α2δ2）、血紅蛋白F（α2γ2） 和異常血紅蛋白。

4α、β珠蛋白基因型分析

中國人常見的α地貧及β地貧的基因檢測按文獻(xiàn)[89]進(jìn)行。缺失型α地貧的檢測采用多重PCR方法；3種非缺失型α地貧和17種點(diǎn)突變型β地貧的檢測采用PCR結(jié)合反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)（RDB法）。α地貧三體型（αααanti37和αααanti42）的檢測按文獻(xiàn)[10]進(jìn)行。

5β珠蛋白單倍型分析

β珠蛋白單倍型分析采用基于PCR的限制型片段長度多態(tài)性（PCRRFLP）技術(shù)和家系連鎖分析方法。選擇的7個經(jīng)典RFLP位點(diǎn)分別為：Hinc Ⅱ5′ε、 Hind ⅢGγ、Hind ⅢAγ、 Hinc Ⅱψβ、 Hinc Ⅱ3′ψβ、Ava Ⅱβ 和 Bam HI3′β，引物序列參考文獻(xiàn)[11]。

6血紅蛋白F表達(dá)水平相關(guān)的主要SNPs的基因型和KLF1基因序列分析

血紅蛋白F表達(dá)水平相關(guān)的主要SNPs包括HBG2的rs7482144（XmmI）、HBS1LMYB的rs9399137和BCL11A的rs766432位點(diǎn)，采用PCR擴(kuò)增后直接測序的方法。KLF1基因的外顯子、內(nèi)含子、5′UTR及3′UTR的分析也采用PCR擴(kuò)增后直接測序的方法[12]。

三、文獻(xiàn)檢索

以“dominantly inherited betathalassemia”“HBB Unstable Hemoglobin” “Hb Dippie”“HBB c 383A>G”和“betathalassemia codon 127”為檢索詞，在PubMed數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索；以“Entries involving the beta gene”為檢索詞，在人類血紅蛋白變異和地中海貧血數(shù)據(jù)庫（HbVar數(shù)據(jù)庫，A database of Human Hemoglobin Variants and Thalassemias）進(jìn)行檢索；以“HBB”為檢索詞，在人類基因突變數(shù)據(jù)庫（HGMD數(shù)據(jù)庫20181版本，The Human Gene Mutation Database）進(jìn)行檢索；以“顯性地中海貧血”“血紅蛋白 Dippie”在中國生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)服務(wù)系統(tǒng)（SinoMed）、中國期刊全文數(shù)據(jù)庫（CNKI）、萬方數(shù)據(jù)知識服務(wù)系統(tǒng)和維普中文科技期刊數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，分析檢索到的攜帶血紅蛋白Dippie突變的患者的資料。上述數(shù)據(jù)庫檢索的截止時間為2018年3月20日。

結(jié)果

一、1例表現(xiàn)為“貧血”的常染色體顯性β地貧患者及其家系成員的病例資料

1病史、實(shí)驗(yàn)室及輔助檢查結(jié)果

患者女，29歲，漢族，因“妊娠23周，貧血加重1周”于2012年4月19日入廣州市番禺區(qū)何賢紀(jì)念醫(yī)院治療。患者長期有輕度貧血，于23歲第1次妊娠中期時貧血加重，但未接受輸血，妊娠38周時行“剖宮產(chǎn)術(shù)”產(chǎn)下一24 kg的健康女嬰。體格檢查：體型偏瘦，發(fā)育正常，營養(yǎng)中等。皮膚蒼白，未見皮疹及出血點(diǎn)。結(jié)膜蒼白，鞏膜輕度黃染，口唇蒼白。心率104次/分，心律整齊，未聞及早搏音，心音有力，主動脈聽診區(qū)可聞及收縮期Ⅲ級吹風(fēng)樣雜音；脾位于左肋下9 cm，質(zhì)地硬，邊緣鈍；肝右肋下、劍突下未觸及。入院前1日門診外周血檢查顯示：血紅蛋白54 g/L，紅細(xì)胞23×1012/L，平均血紅蛋白含量（MCH）232 pg，平均紅細(xì)胞體積（MCV）790 fl，紅細(xì)胞分布寬度（RDW）244%， 網(wǎng)織紅細(xì)胞百分比（RET %）82%，網(wǎng)織紅細(xì)胞絕對值（RET #）1763×109/L。血紅蛋白組分分析顯示：血紅蛋白A 927 %、血紅蛋白A2 39 %，血紅蛋白F 33%；電泳未見異常血紅蛋白條帶；紅細(xì)胞滲透脆性降低；促紅細(xì)胞生成素高于200 mIu/ml；血清鐵測定495 μmol/L，總鐵結(jié)合力838 μmol/L，血清鐵飽和度590%；總膽紅素、直接膽紅素和間接膽紅素分別為571、168和403 μmol/L；維生素B12<150 pg/ml；葉酸29 ng/ml；促紅細(xì)胞生成素>200 mIu/ml；葡萄糖6磷酸脫氫酶（G6PD）水平正常。外周血涂片提示：成熟紅細(xì)胞大小不一，可見球形、橢圓形、淚滴型、嗜多色、嗜堿點(diǎn)彩和碎裂形紅細(xì)胞。骨髓細(xì)胞檢查提示：骨髓增生明顯活躍，粒細(xì)胞與紅細(xì)胞比值為1∶71；紅系增生顯著，占88 %，以中晚幼紅細(xì)胞增生為主。

2治療

患者入院后給予補(bǔ)充甲鈷胺、葉酸，并輸洗滌紅細(xì)胞400 U，次日復(fù)查血紅蛋白82 g/L；4月26日復(fù)查血紅蛋白 76 g/L，再次輸洗滌紅細(xì)胞400 U。血紅蛋白電泳結(jié)果考慮β地貧，但用于檢測中國人常見α、β地貧的檢測方法無發(fā)現(xiàn)該例患者的任何異常。入院診斷：①貧血查因；②孕23周；③脾腫大查因。1周以后，患者自覺無頭暈、乏力等不適，強(qiáng)烈要求出院，按自動出院辦理。在妊娠第39周，患者于外院接受“剖宮產(chǎn)術(shù)”產(chǎn)下一27 kg健康男嬰。

3再次入院及治療過程

2013年3月26日患者因“貧血加重3 d”再次入廣州市番禺區(qū)何賢紀(jì)念醫(yī)院治療。入院3 d前患者自覺頭暈，伴陣發(fā)性頭痛，無胸悶、氣促，無發(fā)熱、畏寒，于我院門診查血常規(guī)示血紅蛋白830 g/L；肝功能示總膽紅素、直接膽紅素和間接膽紅素分別為820、79和740 μmol/L；腹部CT示脾大。遂以“脾功能亢進(jìn)、中度貧血”再收入院。入院后完善相關(guān)檢查，無手術(shù)禁忌證，于3月27日行“部分脾動脈栓塞術(shù)”，術(shù)后患者恢復(fù)良好，病情穩(wěn)定，準(zhǔn)予出院，定期復(fù)查。

二、先證者家系成員的病例資料

先證者的哥哥、母親和外祖母也有貧血和脾腫大，但從未接受輸血和手術(shù)；其外祖母，漢族，在75歲時由于交通事故去世；其兒子，輕度貧血，但肝脾未觸及腫大；其女兒，無貧血及肝脾腫大。家系圖譜見圖1。家系分析表明，該病的遺傳方式可能為常染色體顯性遺傳。

三、血液學(xué)表型資料

表1總結(jié)了該家系4例患者及1例正常對照的血液學(xué)數(shù)據(jù)。3例成年患者均符合類中間型β地貧癥狀，包括中度貧血、黃疸、脾腫大和血紅蛋白A2水平升高；Ⅳ：2，先證者5歲的兒子也出現(xiàn)輕度貧血和血紅蛋白A2水平升高；Ⅳ：1，先證者11歲的女兒各項(xiàng)血液學(xué)表型正常。

四、分子遺傳學(xué)分析

用于檢測中國人常見α、β地貧的檢測方法無發(fā)現(xiàn)該家系患者的任何異常，也無發(fā)現(xiàn)患者存在αααanti37和αααanti42。DNA序列測定顯示，所有患者HBB基因第127密碼子均發(fā)生雜合性突變（c383A>G[beta127（H5）Gln>Arg]），見圖2。先證者表型正常的女兒IV：1，該位點(diǎn)為正常的c383A純合子。突變所在的β珠蛋白單倍型顯示，其與單倍型2[+ +]連鎖。該單倍型常見于中國南方地區(qū)的β珠蛋白基因突變等位基因和正常等位基因中，這表明c383A>G突變無明確的起源[1314]。所有患者血紅蛋白F表達(dá)水平相關(guān)的主要SNPs位點(diǎn)基因型均為HBG2 rs7482144 G/G（XmmI： ）、HBS1LMYB rs9399137 T/T和 BCL11A rs766432 A/A，這些基因型已被證明與中國人β地貧雜合子的最低F細(xì)胞中位數(shù)或最低血紅蛋白F水平相關(guān)[1517]。在血紅蛋白F和血紅蛋白A2表達(dá)中發(fā)揮重要作用的KLF1基因未在患者中發(fā)現(xiàn)功能性變異[1218]。

A：患者HBB基因c383A>G雜合性突變；B：正常人HBB基因c383A序列；箭頭提示突變所在位點(diǎn)五、攜帶血紅蛋白Dieppe突變患者的相關(guān)文獻(xiàn)分析

檢索文獻(xiàn)后共收集到3篇文獻(xiàn)報道了3例攜帶血紅蛋白Dieppe雜合性突變的患者，其中僅1例法國籍患者具有較詳細(xì)的表型資料，見表2。

表2攜帶血紅蛋白Dieppe雜合性突變的病例的統(tǒng)計表序號第一作者患者性別籍貫癥狀血液學(xué)表型1Zhang[7]未知中國云南省未知未知2Girodon[19]女法國類中間型地貧癥狀血紅蛋白75 g/L，血紅蛋白A2 25%，

血紅蛋白F 180%3Haghi[20]未知伊朗未知未知討論

血紅蛋白Dieppe突變由Girodon等[19]于1992年首次報道，該例患者為31歲法國女性，其表現(xiàn)為類中間型地貧癥狀，如慢性貧血（血紅蛋白75 g/L），偶爾需要輸血，脾腫大和中度血色素沉著癥，其血紅蛋白A2含量正常（25%）， 但血紅蛋白F含量高達(dá)180%。由于在血紅蛋白電泳中無發(fā)現(xiàn)異常血紅蛋白帶及異丙醇實(shí)驗(yàn)陰性，故該變異血紅蛋白被認(rèn)為高度不穩(wěn)定。在本研究中，4例成年患者均出現(xiàn)類中間型地貧癥狀，這與法國患者的表型一致。但我們的患者血紅蛋白A2水平較高（44%～55%）而血紅蛋白F含量很低（<33%），這種與上述法國患者的差異原因不明，可能與不同的遺傳背景有關(guān)。在本研究的患者中，血紅蛋白F表達(dá)水平相關(guān)的主要SNPs位點(diǎn)均表現(xiàn)為與最低的F細(xì)胞中位數(shù)或血紅蛋白F水平相關(guān)的基因型；在血紅蛋白F和血紅蛋白A2表達(dá)中發(fā)揮重要作用的KLF1基因，未在患者中發(fā)現(xiàn)功能性變異。這些基因型很可能可以解釋我們患者的低血紅蛋白F水平。

β127Gln位于β珠蛋白肽鏈的α螺旋的H段，與α珠蛋白肽鏈的Arg B12、Ser B16和Val G14殘基相互作用。血紅蛋白Dieppe變異在β127位點(diǎn)引入1個帶正電荷的親水殘基Arg，替代原來的極性中性殘基Gln。該位點(diǎn)Arg到Gln的替換會造成αβ二聚體不穩(wěn)定。變異的α2β2四聚體可以形成，但是帶有胍基團(tuán)的高度陽性的Arg β127 H5殘基會強(qiáng)烈破壞α1β1的接觸，導(dǎo)致蛋白過早水解。因此，蛋白合成之后，所有不穩(wěn)定的血紅蛋白迅速沉淀在骨髓紅細(xì)胞前體的膜上，導(dǎo)致生成無效紅細(xì)胞，這種病理生理機(jī)制引起顯性類中間型地貧癥狀[19]。

除了血紅蛋白Dieppe，已有另外5種位于127位密碼子的突變被發(fā)現(xiàn)，包括3種錯義突變血紅蛋白Complutense（Gln Glu）、血紅蛋白Brest（Gln Lys）和血紅蛋白Houston（Gln Pro），1種無義突變β127（Gln Stop）和血紅蛋白Gunma突變（即3bp缺失導(dǎo)致密碼子127/128位GlnAla被脯氨酸替代）[2124]。這些突變的臨床表型差別很大，血紅蛋白Complutense、血紅蛋白Brest 和血紅蛋白Gunma只引起輕微的β地貧癥狀，而其它突變則引起顯性類中間型地貧癥狀。有趣的是，β127無義突變可引起臨床表型異質(zhì)性。即使在同一家庭中，有些患者有相當(dāng)嚴(yán)重的類中間型地貧表型，出現(xiàn)癥狀2年后就必須行脾切除術(shù)，而具有相同的α、β珠蛋白基因型的其他個體卻無明顯的臨床癥狀[22]。在我們的研究中，先證者Ⅲ：2也比同一家庭中其他攜帶相同血紅蛋白Dieppe成員的癥狀更嚴(yán)重，是他們中唯一行脾動脈栓塞術(shù)的個體。目前，對于不同突變或相同突變導(dǎo)致的表型異質(zhì)性的機(jī)制還不是完全明了，其影響因素可能包括：突變珠蛋白的穩(wěn)定性、αβ珠蛋白二聚體形成的減少程度、個體間處理沉淀的珠蛋白肽鏈的蛋白水解酶活性的差異，以及不同的遺傳背景等[19]。

本研究提示，對于一些具有類中間型地貧癥狀、但常規(guī)檢測α、β地貧的方法卻沒有發(fā)現(xiàn)任何異常的患者，應(yīng)考慮患者可能攜帶少見或罕見的珠蛋白基因突變；若家系分析符合常染色體顯性遺傳方式，應(yīng)考慮顯性遺傳性β地貧的可能。β珠蛋白基因的序列測定有助于發(fā)現(xiàn)這些少見或罕見的突變，從而有利于患者的個性化醫(yī)療和遺傳咨詢。

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[24]Fucharoen S， Fucharoen G， Fukumaki Y， Nakayama Y， Hattori Y， Yamamoto K， Ohba Y Threebase deletion in exon 3 of the betaglobin gene produced a novel variant （beta gunma） with a thalassemialike phenotype Blood，1990，76（9）：18941896