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        三黃瀉心湯體外抑制耐藥金黃色葡萄球菌活性測(cè)定

        2018-09-07 08:13:18王鈺雄劉偉偉李雪萍何熙果王艷秋
        實(shí)用中醫(yī)藥雜志 2018年4期
        關(guān)鍵詞:麥?zhǔn)?/a>瀉心湯菌液

        王鈺雄,劉偉偉,李雪萍,何熙果,王艷秋

        (1.成都中醫(yī)藥大學(xué)2013級(jí)本科生,四川 成都 611137;2.成都中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,四川 成都611137;3.成都中醫(yī)藥大學(xué)2015級(jí)本科生,四川 成都 611137)

        “三黃瀉心湯”亦稱“瀉心湯”,是張仲景的經(jīng)典方劑,由黃連、大黃、黃芩組成,有瀉火解毒、清熱燥濕、除痞止血之功效,是中醫(yī)臨床治療心胃火邪內(nèi)熾證的常用方劑。本研究對(duì)三黃瀉心湯的傳統(tǒng)湯劑進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)耐藥金黃色葡萄球菌和普通耐藥金黃色葡萄球菌的抑菌作用進(jìn)行觀察,探討三黃瀉心湯的抑菌作用。

        1 實(shí)驗(yàn)儀器與藥物

        實(shí)驗(yàn)儀器:恒溫培養(yǎng)箱,凈化工作臺(tái),DHG--9125A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱,壓力蒸汽滅菌器,電子天平等。

        藥物:大黃、黃連、黃芩(成都新荷花藥業(yè)有限公司),營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(成都中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供),普通耐藥金黃色葡萄球菌(成都中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供),標(biāo)準(zhǔn)耐藥金黃色葡萄球菌(中科院生物研究所提供)。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 三黃瀉心湯的制備

        取中藥飲片大黃10g,黃連5g,黃芩5g(質(zhì)量比為2∶1∶1)混合,加300mL純化水浸泡30 min,煎煮60 min,后濃縮為200mL,制成含生藥1g/mL藥液,即每1mL濃縮液相當(dāng)于原生藥1g,過(guò)濾后放入燒杯內(nèi)密封,置4℃保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)時(shí),稀釋至相應(yīng)濃度。

        2.2 0.5麥?zhǔn)纤幟艟旱闹苽?/p>

        0.5麥?zhǔn)媳葷峁埽?.2mL0.25%BaCl2、9.8mL1%H2SO4,約1×108/mL。1麥?zhǔn)媳葷峁埽?.4mL0.25%BaCl2、9.6mL1%H2SO4,約3×108/mL。

        普通耐藥菌菌液。將純化的普通耐藥菌接種于普通瓊脂平板上,做好標(biāo)記,35℃培養(yǎng)24 h,無(wú)菌操作挑取新鮮培養(yǎng)的菌落,加入3mL的無(wú)菌生理鹽水試管中,混勻后與0.5麥?zhǔn)虾?麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)管比較,逐步調(diào)整菌液濃度至0.5麥?zhǔn)献笥?,作為供試菌液?/p>

        標(biāo)準(zhǔn)耐藥菌菌液。按說(shuō)明書方法,在超凈臺(tái)復(fù)蘇細(xì)菌。用接種環(huán)蘸取菌液,直接涂布到瓊脂平板上,做好標(biāo)記35℃培養(yǎng)24h。按上述方法制作0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)耐藥菌,作為供試菌液。

        2.3 最低抑菌濃度(MIC)測(cè)定及結(jié)果

        二倍試管稀釋法。取無(wú)菌試管10只,編號(hào)A1-A10,于A2-A10中加入10mL無(wú)菌水,取中藥原液20mL,于A1中加入10mL。A2中加入10mL,混合后取出10mL,加入到A3中,以此類推至A9,混合后取出10mL,棄之。A10中只有無(wú)菌水。這樣就形成了從A1-A9濃度依次為10%(1∶10)、5%(1∶20)、2.5%(1∶40)、1.25%(1∶80)、0.625%(1∶160)、0.3125%(1∶320)、0.15625%(1∶640)、0.078125%(1∶1280)、0.0390625%(1∶2560)。

        制備含藥瓊脂培養(yǎng)基。瓊脂培養(yǎng)基配方為:牛肉膏3.0g,蛋白胨10.0g,氯化鈉5.0g,瓊脂20g,溶解于1000mL純水中,pH=7.3±0.1。

        取上述540mL培養(yǎng)基,分裝于10個(gè)燒瓶,每個(gè)54mL,編號(hào)B1-B10,取上述稀釋中藥液,按6mLA1加入B1,6mLA2加入B2,以此類推,逐次將藥液與培養(yǎng)基混勻,混合后于121℃高壓滅菌15min,冷至50℃時(shí),將B1中培養(yǎng)基在超凈臺(tái)上分別傾注6個(gè)平皿,每個(gè)10mL含藥培養(yǎng)基,重新編號(hào)。濃度由高到低依次為A1、A2、A3、A4、A5、A6……J1、J2、J3、J4、J5、J6共60個(gè)培養(yǎng)皿。放4℃?zhèn)溆?。這樣每個(gè)培養(yǎng)基的含藥濃度為對(duì)應(yīng)2.3.1中藥液濃度的1/10。另制備若干普通瓊脂培養(yǎng)基備用[1]。

        接種。在超凈臺(tái)內(nèi),用接種環(huán)蘸取上述0.5麥?zhǔn)掀胀退幘?,在管壁擠壓去多余的菌液,均勻地涂布在A-J組的平板上,另用燒灼滅菌的接種環(huán)在未編號(hào)的空白瓊脂培養(yǎng)基上,以接種的操作劃線。將上述61個(gè)平板置于35℃溫箱,培養(yǎng)24h。24h后觀察并記錄各平板結(jié)果,以無(wú)菌生長(zhǎng)的含藥平板的藥濃度為普通耐藥菌MIC。同樣的操作,確定標(biāo)準(zhǔn)耐藥菌MIC。

        結(jié)果顯示,三黃瀉心湯對(duì)標(biāo)準(zhǔn)耐藥金黃色葡萄球菌、普通耐藥金黃色葡萄球菌的MIC分別為2.5mg/mL、0.3125mg/mL,空白培養(yǎng)基未見細(xì)菌生長(zhǎng)。結(jié)果見表1-2。

        表1 不同濃度三黃瀉心湯對(duì)普通耐藥金黃色葡萄球菌抑菌作用測(cè)定結(jié)果 (mg/mL)

        表2 不同濃度三黃瀉心湯對(duì)標(biāo)準(zhǔn)耐藥金黃色葡萄球菌抑菌作用測(cè)定結(jié)果 (mg/mL)

        3 討 論

        三黃瀉心湯中大黃、黃連和黃芩三味中藥,其各成分均有一定抗菌作用[2]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示三黃瀉心湯具有抑制MRSA的作用,對(duì)臨床分離的普通耐藥性金黃色葡萄球菌的抑制作用強(qiáng)于標(biāo)準(zhǔn)MRSA。

        現(xiàn)代研究證實(shí),MRSA細(xì)菌耐藥的原因與β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生和青霉素結(jié)合蛋白2a(PBP2a)的產(chǎn)生有關(guān),PBP2a是一種β-內(nèi)酰胺類抗生素低親和性蛋白,在MRSA細(xì)菌耐藥中起著主要的作用[3]。FtsZ蛋白是最早出現(xiàn)的細(xì)菌分裂蛋白,在細(xì)胞分裂中起主要作用,介導(dǎo)PBP2在細(xì)胞分裂過(guò)程中插入到細(xì)胞膜中,由于PBP2是MRSA抗β內(nèi)酰胺類抗菌素所需要的,因此破壞其活性可重新使MRSA對(duì)β內(nèi)酰胺類變得敏感。抑制FtsZ蛋白還能抑制MRSA的生長(zhǎng)和生存能力。因此我們推測(cè)FtsZ蛋白有可能是三黃瀉心湯治療MRSA的作用靶點(diǎn)之一。

        本研究表明,三黃瀉心湯對(duì)普通耐藥菌和標(biāo)準(zhǔn)耐藥菌均有較強(qiáng)的抑制作用,對(duì)前者的活性是后者的8倍,由此證明三黃瀉心湯對(duì)耐藥菌有較強(qiáng)的抑制作用,但三黃瀉心湯對(duì)于FtsZ的作用影響有待進(jìn)一步研究。

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