袁宏佳，郭洪明，梅 嬌，劉興文，姜 展

（重慶市北碚區(qū)中醫(yī)院，重慶 410007）

痔瘡?fù)庀捶綖橹腥A人民共和國(guó)衛(wèi)生部部頒標(biāo)準(zhǔn)收載的散劑，是我院常用醫(yī)院制劑，由芒硝、黃連、魚腥草等組成，具有祛毒止癢、消腫止痛等功效，臨床用于治療痔瘡漏瘡、肛門痛癢療效顯著。方中黃連具有清熱燥濕，瀉火解毒的作用［1］。其主要有效成分為表小檗堿、黃連堿、巴馬汀、小檗堿等生物堿。參考相關(guān)文獻(xiàn)［2-10］，選擇鹽酸小檗堿作為本試驗(yàn)的指標(biāo)成分，并采用高效液相色譜法測(cè)定其含量，為痔瘡?fù)庀搭w粒的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

LC-20AT液相色譜儀（日本島津），SPD-20A紫外檢測(cè)器（日本島津），LC-solution色譜工作站，色譜柱：InertSustain C18，5μm，4.6mm×250mm（日本島津），十萬(wàn)分之一電子天平（瑞士梅特勒公司），SY1200T型超聲儀（上海聲源超聲波儀器設(shè)備有限公司），PTK-R1-10L型實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)（帕泰克）。

鹽酸小檗堿對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所提供：批號(hào)713-9404），痔瘡?fù)庀搭w粒（由北碚區(qū)中醫(yī)院制劑室生產(chǎn)，批號(hào)：2017040-1，2017040-2，2017040-3），乙腈為色譜醇，水為超純水，其余化學(xué)試劑為分析純。

2 試驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：InertSustain C18（4.6mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液（30：70）；流速：1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：345nm；進(jìn)樣量：10μL；柱溫：30℃；理論塔板數(shù)按鹽酸小檗堿峰計(jì)算大于15000。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取鹽酸小檗堿對(duì)照品約16mg，置于100mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得濃度為160μg/mL的對(duì)照品溶液。再精密吸取對(duì)照品溶液0.5、1、2、4、8mL，分別置于10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得鹽酸小檗堿對(duì)照品稀釋貯備液，并分別標(biāo)記為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ。

2.3 供試品溶液的制備

稱取痔瘡?fù)庀搭w粒約2.5g，研細(xì)，精密稱定，置于具塞三角錐形瓶中，加入甲醇-鹽酸（100：1）的混合溶液50mL，密塞，稱定重量，超聲處理30min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，用0.45μm微孔濾膜濾過，濾液即為供試品溶液。

2.4 陰性對(duì)照品溶液的制備

取方中藥材（除去黃連）按痔瘡?fù)庀搭w粒制備工藝同法制得缺黃連的陰性樣品。再稱取上述顆粒約2.5g，研細(xì)，精密稱定，按“2.3”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.5 方法專屬性試驗(yàn)

精密吸取鹽酸小檗堿對(duì)照品稀釋貯備液Ⅰ、供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液各10μl，分別注入色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，得色譜圖，詳見圖1。

圖1（A為鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液 B為痔瘡?fù)庀搭w粒樣品溶液 C為陰性對(duì)照溶液）

鹽酸小檗堿對(duì)照品保留時(shí)間在14分鐘左右，供試品溶液在相應(yīng)位置也檢測(cè)到鹽酸小檗堿的峰，而陰性對(duì)照品溶液在此保留時(shí)間無(wú)干擾。表明處方中其他藥材不干擾鹽酸小檗堿的含量。

2.6 線性關(guān)系考察

精密吸取對(duì)照品稀釋貯備液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ各10μl，進(jìn)樣，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定鹽酸小檗堿峰面積（A），并以其為縱坐標(biāo)，同時(shí)以鹽酸小檗堿進(jìn)樣濃度（C）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為A=39 129.4C+6 826.52，表明鹽酸小檗堿檢測(cè)濃度在8.447 5～135.16μg/ mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.999 9）。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液，按含測(cè)依法操作后，立即進(jìn)樣測(cè)定，并每隔一定時(shí)重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定一次，持續(xù)6h，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，鹽酸小檗堿的峰面積積分值相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.37%，結(jié)果表明鹽酸小檗堿在6h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 精密度試驗(yàn)

取供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定其峰面積積分值，結(jié)果統(tǒng)計(jì)：鹽酸小檗堿峰面積積分值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=0.07%。

2.9 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)的痔瘡?fù)庀搭w粒，依法重復(fù)操作測(cè)定5次，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，測(cè)得鹽酸小檗堿的平均含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=1.21%。

2.10 回收率試驗(yàn)

采用加樣回收法，取已知含量的同一批號(hào)樣品，分別精密加入一定量的鹽酸小檗堿對(duì)照品，依法操作進(jìn)樣測(cè)定，同法重復(fù)試驗(yàn)6次，測(cè)得鹽酸小檗堿的平均回收率為100.04%，RSD=1.34%。

表1 加樣回收率試驗(yàn) （6次）

2.11 樣品含量測(cè)定

精密稱取不同批號(hào)的痔瘡?fù)庀搭w粒2.5g，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件精密進(jìn)樣10μl，測(cè)定。計(jì)算痔瘡?fù)庀搭w粒中鹽酸小檗堿含量，結(jié)果詳見表2。

表2 樣品的含量測(cè)定結(jié)果 （2次）

3 討 論

本品處方由7味中藥組成，而黃連為方中要藥，大量文獻(xiàn)報(bào)道鹽酸小檗堿為黃連中的主要活性成分，具有顯著的抗菌、消炎等作用。因此，選擇黃連中的鹽酸小檗堿作為含測(cè)指標(biāo)成分，基本上能夠達(dá)到控制質(zhì)量的目的。參考有關(guān)文獻(xiàn)含量測(cè)定方法［2-10］，并經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)條件摸索，選擇了高效液相法測(cè)定本品中鹽酸小檗堿的含量，具有方法靈敏、簡(jiǎn)便，分離度、重現(xiàn)性好的特點(diǎn)。

檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇。鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液在200～600nm進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果在345nm波長(zhǎng)處制劑中鹽酸小檗堿能有效分離，故選擇345nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

參考相關(guān)文獻(xiàn)［2-10］，確定以乙腈-0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液為流動(dòng)相，對(duì)流動(dòng)相的不同比例進(jìn)行考察，結(jié)果以乙腈-0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液（30∶70）為最佳，基線平穩(wěn)，鹽酸小檗堿分離最好，保留時(shí)間適中（約14分鐘）。

提取條件的選擇。本實(shí)驗(yàn)采用水浴加熱回流提取、超聲提取、冷浸法分別對(duì)痔瘡?fù)庀搭w粒進(jìn)行處理，考察不同提取方式對(duì)鹽酸小檗堿含量的影響。結(jié)果表明水浴加熱回流提取與超聲提取對(duì)于鹽酸小檗堿的溶出量差別不明顯，而冷浸法提取周期長(zhǎng)，提取效率低，故從提取方法的簡(jiǎn)便性，提取效率方面考慮，最終選擇超聲提取方法。并且分別考察了用100%甲醇、50%甲醇、甲醇-鹽酸（100∶1）的混合溶液對(duì)痔瘡?fù)庀搭w粒進(jìn)行處理，結(jié)果表明甲醇-鹽酸（100∶1）的混合溶液提取效果最佳。而對(duì)于提取時(shí)間就分別考察了15min、30min、45min、60min對(duì)鹽酸小檗堿含量的影響，結(jié)果表明隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，鹽酸小檗堿的含量無(wú)明顯變化，故選擇30min提取時(shí)間為宜。

HPLC法簡(jiǎn)單、快速、重現(xiàn)性好，可用于制劑的質(zhì)量控制。