潘大波，姜德文，張永豪，吳明凱，龍治峰

（黔東南民族職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州 凱里 556000）

0 引言

神經(jīng)氨酸酶抑制劑是抗流感病毒一類重要的藥物。目前神經(jīng)氨酸酶抑制劑主要有拉尼米韋，拉尼米韋辛酸酯、奧司米韋、帕拉米韋和扎那米韋等。其中拉尼米韋辛酸酯是拉尼米韋的前藥，在體內(nèi)代謝成拉尼米韋而發(fā)揮抗流感活性[1-2]。研究顯示拉尼米韋的抗病毒譜廣，包括N1、N7等[3-4]。為了探討拉尼米韋能否抵抗新型亞型流感病毒H17N10，我們采用分子模擬的方法考察拉尼米韋與各種亞型NA的結(jié)合特征來闡釋它抗病毒的分子機(jī)制[5]。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

從PDB數(shù)據(jù)庫中獲得H1N1pdm和H7N9神經(jīng)氨酸酶蛋白-LAN復(fù)合物（蛋白ID：3TI3和4MWU）。H17N10的神經(jīng)氨酸酶拉尼米韋復(fù)合物由H17N10的神經(jīng)氨酸酶（蛋白ID：4GDI）與H7N9神經(jīng)氨酸酶蛋白-LAN復(fù)合物疊合獲得。晶體中的Ca離子和水分子保留。刪掉不合理的結(jié)構(gòu)。

1.2 分子動力學(xué)模擬

分子動力學(xué)模擬在Amber軟件中模擬完成。拉尼米韋分子參數(shù)用Amber的BCC方法擬合電荷，用GAFF方法獲得其參數(shù)。蛋白運(yùn)用14SB立場。體系加12 ?水盒子和抗離子。分子動力學(xué)模擬過程經(jīng)歷體系最小化、體系加熱、平衡和生產(chǎn)相模擬四部分。每個體系模擬200 ns。

1.3 結(jié)合自由能計算與氨基酸殘基能量分解

選取每條軌跡的250個結(jié)構(gòu)運(yùn)用MM-GBSA的方法計算神經(jīng)氨酸酶與拉尼米韋之間的結(jié)合自由能。溶劑和溶質(zhì)的介電常數(shù)分別為80和4。氨基酸殘基能量分解的參數(shù)與結(jié)合自由能計算的參數(shù)一樣。

2 結(jié)果

2.1 分子動力學(xué)模擬平衡考察

檢測體系在200 ns模擬過程中配體周圍8 ?以內(nèi)的氨基酸碳α的RMSD隨時間的變化，在整過模擬過程中，體系的RMSD趨于平衡確在1-1.5 ?之間波動，說明在整過模擬過程中，體系處于平衡的過程。然而，N10體系的波動比N1和N9的大，這可能是N10與拉尼米韋的結(jié)合不是特別穩(wěn)定導(dǎo)致的。

2.2 拉尼米韋與神經(jīng)氨酸酶的結(jié)合親和力

運(yùn)用MM-GBSA計算拉尼米韋與各種亞型神經(jīng)氨酸酶的結(jié)合自由能如表1所示。拉尼米韋與H1N1pdm和H7N9的結(jié)合自由能（ΔGbind）分別為-36.96 kcal/mol和-33.07 kcal/mol，而拉尼米韋與H17N10的結(jié)合自由能為-18.48 kcal/mol。其中極性相互作用（ΔGpolar）和非極性相互作用（ΔGnonpolar）都是負(fù)值，均有利于拉尼米韋與神經(jīng)氨酸酶的結(jié)合。

表1 拉尼米韋與神經(jīng)氨酸酶的結(jié)合自由能（kcal/mol）

2.3 神經(jīng)氨酸酶氨基酸對拉尼米韋的能量貢獻(xiàn)

為了弄清H1N1pdm-LAN和H17N10與拉尼米韋的結(jié)合差異，運(yùn)用MM-GBSA計算神經(jīng)氨酸酶的氨基酸殘基對拉尼米韋的能量貢獻(xiàn)（圖1）顯示，在H1N1pdm-LAN體系中，對拉尼米韋的結(jié)合能量貢獻(xiàn)大于1 kcal/mol的氨基酸為Arg292、Glu227、Glu119、Tyr406、Arg371、Arg152、Trp178、Asp151和Arg224。將H17N10的氨基酸能量貢獻(xiàn)值減去H1N1pdm-LAN發(fā)現(xiàn)H17N10的氨基酸存在大于1 kcal/mol的氨基酸7個，這些氨基酸不利于H17N10與拉尼米韋的結(jié)合。

圖1 （A）H1N1pdm-LAN體系NA中氨基酸殘基能量貢獻(xiàn)值

圖1 （B）H17N10與H1N1pdm的氨基酸殘基能量貢獻(xiàn)值之差

3 討論

由拉尼米韋與 H1N1pdm和H7N9和的結(jié)合自由能顯示，拉尼米韋在抗H1N1pdm和H7N9的作用較好，這在前期很多的實(shí)驗(yàn)中得到驗(yàn)證。然而，對于新出現(xiàn)的H17N10，計算拉尼米韋與H17N10的神經(jīng)氨酸酶的結(jié)合自由能比拉尼米韋與H1N1pdm或H7N9的結(jié)合親和力弱約15 kcal/mol，這表明拉尼米韋抗H17N10的能力較弱[6-8]。

為什么會出現(xiàn)這樣的情況，通過H1N1pdm和H17N10的神經(jīng)氨酸酶序列比對發(fā)現(xiàn)，拉尼米韋與H1N1pdm結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸在H17N10的序列不同，氨基酸性質(zhì)各異導(dǎo)致與拉尼米韋的親和力不一樣，例如119為氨基酸，在H1N1pdm為Gln，能量貢獻(xiàn)值為-2.24 kcal/mol，在H17N10為Arg，能量貢獻(xiàn)值僅為-0.06 kcal/mol，氨基酸151位、152位、292位、371位和406位等均存在類似的不利于拉尼米韋與H17N10的神經(jīng)氨酸酶結(jié)合的情況[9-10]。

通過運(yùn)用分子動力學(xué)模擬的方法考察拉尼米韋與不同神經(jīng)氨酸酶亞型的結(jié)合親和力可以快速判斷拉尼米韋對不同的神經(jīng)氨酸酶亞型具有活性。同時通過能量分解可以闡釋拉尼米韋與神經(jīng)氨酸酶結(jié)合的詳細(xì)作用機(jī)制。