魏影 郭妍 柏柳 陳艷麗 黃嶸赫 余治健 鄧啟文 李桂秋

作者單位：1 黑龍江省醫(yī)療服務(wù)管理評價中心考核準(zhǔn)入科，黑龍江 哈爾濱 150081；2 深圳市南山區(qū)人民醫(yī)院中心實驗室，廣東深圳 518052

糞腸球菌感染大多數(shù)為內(nèi)源性感染，能通過機體腸上皮細胞而易位，接著感染淋巴結(jié)，然后再擴散到機體的其他細胞組織，在醫(yī)院內(nèi)可引起人體多系統(tǒng)感染：泌尿系感染、皮膚軟組織感染、呼吸道感染等，還能引起危及生命的心內(nèi)膜炎、腹腔感染、敗血癥等[1-4]。生物膜形成是糞腸球菌的重要特點。近年研究表明四環(huán)素耐藥糞腸球菌已經(jīng)成為較高的比例，文獻報道我國糞腸球菌四環(huán)素耐藥率波動60%左右。細菌對四環(huán)素產(chǎn)生耐藥主要是獲得了四環(huán)素耐藥基因，并且這些基因常與可移動成分如可傳遞性質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、接合轉(zhuǎn)座子和整合子接合導(dǎo)致其在菌群間廣泛傳播。然而四環(huán)素耐藥糞腸球菌的耐藥基因特點和生物膜形成之間關(guān)系鮮見報道。多個毒性因素與糞腸球菌生物膜的形成有關(guān)，糞腸腸球菌的毒力因子有聚類物質(zhì)、表面蛋白、細胞溶解素、明膠酶E、透明質(zhì)酸酶、信息素誘導(dǎo)蛋白、膠原結(jié)合蛋白、心內(nèi)膜炎抗原及信息素等。四環(huán)素耐藥糞腸球菌中這些毒力因子的分布尚不清楚。因此，本實驗主要探討四環(huán)素耐藥糞腸球菌生物膜形成特點及與毒力基因、耐藥基因分布之間的關(guān)系，分析該類細菌生物膜形成特點。

1 材料和方法

1.1 材料

251株自深圳市南山醫(yī)院2010年1月—2017年6月分離自患者標(biāo)本的糞腸球菌，質(zhì)控菌株是糞腸球菌菌株ATCC29212和OG1RF （ATCC47077）。

1.2 方法

1.2.1 菌株鑒定和藥敏試驗 采用BD Phoenix-100全自動細菌鑒定/藥敏系統(tǒng)進行藥敏試驗，主要藥物包括氨芐西林和萬古霉素。采用2017年版美國臨床和實驗標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（CLSI）推薦的微量肉湯稀釋法再次確認四環(huán)素藥敏結(jié)果，以糞腸球菌ATCC29212作為質(zhì)控菌株。四環(huán)素敏感、中介和耐藥判斷標(biāo)準(zhǔn)為MIC≤4 mg/L、MIC=8 mg/L和MIC≥16 mg/L。

1.2.2 毒力基因的檢測 毒力基因esp、gelE、Asa1、cylA、hyl引物由北京六合華大基因公司合成[5-6]。按試劑盒說明提取菌株基因組DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩２捎肞CR檢測毒力基因。PCR體系（50 μl）：Dream Taq Green PCR Master Mix（2×） 25 μl，上、下游引物各 1 μl，DNA2 μl， 加 dd H2O 補至 50 μl。PCR 反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30個循環(huán)；72℃ 10 min，PCR產(chǎn)物于4℃保存。PCR反應(yīng)產(chǎn)物均用1%的瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)有無陽性擴增產(chǎn)物及目的基因片段長度進行判斷分析。

1.2.3 生物膜檢測及判讀 根據(jù)參考方法，對生物膜的形成進行了檢測。對在TSB培養(yǎng)基中過夜生長的細菌；稀釋200與TSBG培養(yǎng)基中，其中有0.5%的葡萄糖；每孔200 μl加樣到96孔聚苯乙烯微板上，每個菌株3個復(fù)孔；37℃的情況下靜態(tài)孵化24小時；吸干孔子菌液并用PBS清洗3次，用甲醇固定15分鐘后吸干，用0.5%的結(jié)晶紫染色10分鐘后吸干，再用蒸餾水沖洗；最后加入4∶ 1無水乙醇和丙酮的匯合溶液，混合均勻后在OD570光度下檢測。每一項試驗至少進行3次。生物膜OD值的判讀在染色后的96個微孔讀數(shù)從0.05～3.50。生物膜表型分類基于他人的方法，強陽性（OD 570＞2），中等（OD 570，1～2），或弱（OD 570＞0.5和OD 570＜1）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析方法

采用Execl表格建立數(shù)據(jù)庫，統(tǒng)計入組菌株各項指標(biāo)結(jié)果，采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。用t檢驗進行連續(xù)性變量的單因素分析，采用χ2檢驗或Fisher’s確切概率法分析分裂變量。所有檢驗都是雙側(cè)的，當(dāng)P＜0.05時，認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四環(huán)素耐藥糞腸球菌生物膜的形成特點

在結(jié)晶紫染色后的96孔板讀數(shù)從0.04～3.50。生物膜表型分類基于他人的方法分為（OD570＞2），中等（OD570，1～2），或弱（OD570＞0.5和＜1.0）[7-9]。OG1RF控制菌株（弱生物膜）和ATCC29212菌株OD570的中值分別為0.95和0.22。在所有被檢測的糞腸球菌分離菌株中，有超過一半的糞腸生物膜表現(xiàn)為弱陽性及以上，在這些生物膜形成的菌株中，弱生物膜表型、中等生物膜表型和強生物膜表型中菌株數(shù)相差不大。利用肉湯稀釋法測定了四環(huán)素的MIC值，并對MIC16 μg/ml的抗性標(biāo)準(zhǔn)進行了分類，發(fā)現(xiàn)199株含有四環(huán)素抗性的菌株，沒有萬古霉素耐藥株。四環(huán)素敏感、中介和耐藥的糞腸球菌生物膜形成的流行率為50.0%（17/34）、55.6%（10/18）和59.3%（118/199），見表1。生物膜的形成比率有逐步升高的趨勢，值得注意的是強生物形成比例在四環(huán)素耐藥和中介菌株中高于四環(huán)素敏感組（19.6% vs.16.7%vs.8.8%），中介組和耐藥組強生物膜形成比例差別沒有統(tǒng)計學(xué)意義。這些糞腸球菌沒有氨芐西林和萬古霉素耐藥株。

2.2 四環(huán)素耐藥糞腸球菌生物膜形成與四環(huán)素耐藥基因之間的聯(lián)系

PCR檢測結(jié)果提示四環(huán)素耐藥糞腸球菌的耐藥基因tetM和tetL陽性檢出率分別為87.9%（175/199）和25.6%（51/199）；沒有檢測到一株tetS基因陽性株，tetM和tetL耐藥基因與生物膜形成之間關(guān)系仍有待進一步研究。tetM和tetL基因與生物膜形成經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析無相關(guān)性（P＞0.05），見表2。

2.3 生物膜形成與毒力基因間的相關(guān)性

199株糞腸球菌四環(huán)素耐藥的菌株，對PCR擴增毒性基因的分析表明，esp、asal和cylA陽性糞腸球菌分離菌株比其相對應(yīng)的陰性分離株的生物膜形成率提高，其與生物膜形成經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析有相關(guān)性（P＜0.05）；而hyl基因與其結(jié)果正好相反，但其與生物膜形成經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析也有相關(guān)性（P＜0.05）；此外，生物膜的形成與gelE毒力基因無相關(guān)性（P＞0.05）（見表3）。

3 結(jié)論

本研究結(jié)果提示四環(huán)素耐藥糞腸球菌的生物膜陽性率（59.3%）與四環(huán)素中介組和四環(huán)素敏感組差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，可能與四環(huán)素敏感菌株組合中間組入組例數(shù)太少有關(guān)，四環(huán)素不耐藥組的糞腸球菌生物膜形成比例有待進一步研究?？傮w而言，四環(huán)素耐藥糞腸球菌生物膜陽性與糞腸球菌整體陽性率相比并沒有偏高，但是四環(huán)素耐藥組和中介組中強陽性的菌株比例高于敏感組是需要引起注意。糞腸球菌生物膜形成和抗生素耐藥關(guān)系的研究報道較多。本研究四環(huán)素耐藥組中無萬古霉素和氨芐西林耐藥株，因此對于四環(huán)素耐藥菌株中這些多重耐藥菌株的生物膜特點仍有待進一步研究。四環(huán)素耐藥基因的檢測中發(fā)現(xiàn)，糞腸球菌主要攜帶tetM基因，tetM、tetL和tetS基因與生物膜的形成沒有相關(guān)性。我們的整體結(jié)果提示在四環(huán)素耐藥糞腸球菌中抗生素的敏感性與生物膜的形成無相關(guān)性，四環(huán)素耐藥基因tetM、tetL和tetS與生物膜形成無相關(guān)性。

表1 生物膜形成能力和四環(huán)素敏感性之間的關(guān)系（n，%）

表2 四環(huán)素耐藥基因和生物膜形成之間的關(guān)系（n，%）

表3 四環(huán)素耐藥糞腸球菌中生物膜形成能力與毒力基因之間關(guān)系

本研究發(fā)現(xiàn)四環(huán)素耐藥糞腸球菌中esp+分離株更有可能表現(xiàn)出強或中等的生物膜形成，這與之前的幾項研究一致，這些研究表明該毒力基因和糞腸球菌生物膜形成之間聯(lián)系[5-6，10-13]。本研究提示gelE基因與糞腸球菌強陽性生物膜形成成反比；這與先前的研究結(jié)果中g(shù)elE可能有利于糞腸球菌生物膜的發(fā)展不一樣，但也有另一些研究則發(fā)現(xiàn)，在糞腸球菌中，gelE的存在與生物膜的形成沒有相關(guān)性[3]。此為本實驗中還發(fā)現(xiàn)四環(huán)素耐藥糞腸球菌中asal 、hyl和cylA與糞腸球菌生物膜的形成有相關(guān)性；此前有報道稱，cylA與尿道分離的糞腸球菌生物膜形成有關(guān)[4]。因此四環(huán)素耐藥糞腸球菌中esp、asal、hyl和cylA等毒力基因與生物膜形成密切相關(guān)。

總之，目前的研究表明四環(huán)素耐藥糞腸球菌容易形成生物膜，生物膜形成陽性率與四環(huán)素中介菌株比較無差別。四環(huán)素耐藥糞腸球菌中抗生素的敏感性與生物膜的形成無相關(guān)性，四環(huán)素耐藥糞腸球菌生物膜形成能力與四環(huán)素耐藥基因tetM、tetL和tetS基因無相關(guān)性。esp、asal、hyl和cylA與四環(huán)素耐藥糞腸球菌生物膜形成顯著性相關(guān)。