劉 慧，劉杰超，呂真真，楊文博，張春嶺，焦中高*

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 鄭州果樹研究所，河南 鄭州 450009）

藍莓為杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vacciniumspp.）植物，果實富含糖、酸、蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素和膳食纖維等，還含有豐富的酚類物質(zhì)如花色苷、酚酸、類黃酮等，具有很強的清除自由基的作用[1-2]，具有減肥、促進視紅素合成、改善糖尿病并發(fā)癥、抗炎、抗心血管疾病、抗癌、抗衰老等多種生理活性功能[3-6]。被稱為“漿果之王”，聯(lián)合國糧農(nóng)組織將其列入“人類五大健康食品之一”[7]。

由于藍莓成熟期正值夏季，且生產(chǎn)時間集中，果實不易貯藏、運輸，容易造成積壓[8]。推動藍莓加工產(chǎn)業(yè)發(fā)展是解決這些問題的主要途徑，加工制品中的藍莓汁及藍莓酒可以較好的保留原料的營養(yǎng)物質(zhì)，發(fā)酵過程還會產(chǎn)生新的風(fēng)味物質(zhì)及功能活性物質(zhì)，成為藍莓加工產(chǎn)品中的主導(dǎo)[9]?；ㄉ铡㈩慄S酮等多酚類物質(zhì)是藍莓酒中的一類重要化合物，與酒的品質(zhì)密切相關(guān)，同時還與藍莓酒的抗氧化能力呈正相關(guān)關(guān)系[10]。但加工過程極易引起藍莓中活性物質(zhì)的分解，降低其營養(yǎng)價值，因此選擇合適的加工條件保留藍莓果實豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，成為藍莓加工領(lǐng)域的研究熱點，對優(yōu)化發(fā)酵工藝、指導(dǎo)藍莓加工生產(chǎn)實際有著積極的推動作用[11]。然而，目前對藍莓汁、藍莓酒的研究多集中在以出汁率、酒精度或感官品質(zhì)為評價指標(biāo)的工藝優(yōu)化方面，有關(guān)藍莓加工過程中主要成分的變化情況已經(jīng)有一些研究[12-13]，而對類黃酮物質(zhì)的相關(guān)研究較少。該研究通過對藍莓制汁及發(fā)酵過程中類黃酮及花色苷物質(zhì)的含量分析，探討不同加工工藝對藍莓主要活性成分的影響，為藍莓汁及藍莓酒的加工提供一定的理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍莓（品種“粉藍”）：采自連云港市贛榆區(qū)沙河鎮(zhèn)。

酵母：實驗室保存的Ⅱ#釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），接種時細胞數(shù)2×108CFU/mL；白砂糖（食品級）：市售；果膠酶（26 000 PG/mL）、果漿酶（30 000 UPTE/mL）、α-淀粉酶（460 AGU/mL）（食品級）、纖維素酶（8 200 U/g）：諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司；蘆丁標(biāo)準品（純度≥98%）：中國食品藥品檢定研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

JYL-G12料理機：九陽股份有限公司；PAL-1迷你數(shù)顯糖度計：日本ATAGO公司；LRH-250A生化培養(yǎng)箱，韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司；L-550離心機：湘儀離心機儀器有限公司；Jena 50紫外可見分光光度計：德國耶拿分析儀器股份公司；SHA-22水浴恒溫振蕩器：金壇精達儀器制造有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 藍莓制汁工藝

（1）藍莓制汁工藝流程

（2）酶解工藝參數(shù)優(yōu)化

在前期試驗基礎(chǔ)上，固定酶解溫度60℃、酶解2 h，酶添加量3‰，考察酶種類（不加酶、果膠酶、果漿酶、纖維素酶、淀粉酶）對藍莓出汁率、可溶性固形物（soluble solid content，SSC）、花色苷和類黃酮含量的影響；固定果漿酶60℃酶解2 h，考察酶添加量（0、1‰、3‰、5‰）對各指標(biāo)的影響；固定添加3‰果漿酶酶解2 h，考察酶解溫度（40℃、50℃、60℃、70℃）對各指標(biāo)的影響；固定添加3‰果漿酶，酶解溫度60 ℃，考察酶解時間（0、0.5 h、1.0 h、2.0 h、3.0 h）對各指標(biāo)的影響。

（3）指標(biāo)測定

出汁率的測定：分別稱取果漿和離心后收集的上清液的質(zhì)量，出汁率計算公式如下。

可溶性固形物的測定：手持糖度計測定。

花色苷、類黃酮含量測定：參考XIAO Z B等[14]的方法，pH示差法測定花色苷含量，以矢車菊素-3-葡萄糖苷的含量表示；硝酸鋁比色法測定類黃酮含量，以蘆丁含量表示；單位為mg/100 mL。

1.3.2 藍莓酒發(fā)酵工藝

（1）藍莓酒加工工藝流程

藍莓打漿→酶解（3‰果漿酶、60℃、2h）→添加亞硫酸（50mg/L）→調(diào)整糖度→接菌→主發(fā)酵（10 d）→過濾→后發(fā)酵（18 d）→原酒

（2）發(fā)酵工藝參數(shù)優(yōu)化

在前期試驗基礎(chǔ)上，固定發(fā)酵溫度25℃、接菌量4%的條件，選擇藍莓原果漿（不加糖，初始SSC 14.5%），分別考察添加不同量的外源糖（0、5%、10%）對藍莓酒花色苷和類黃酮含量的影響；固定選用藍莓原果漿，在接菌量4%條件下，分別考察發(fā)酵溫度（20℃、25℃、30℃）對藍莓酒發(fā)酵過程中花色苷和類黃酮含量的影響；固定選用藍莓原果漿，在發(fā)酵溫度25℃條件下，考察接菌量（2%、4%、6%）對藍莓酒花色苷和類黃酮含量的影響。

（3）取樣及指標(biāo)測定

在藍莓酒發(fā)酵前期，每天取樣一次，發(fā)酵后期取樣間隔增大至3d、5d和8d。藍莓酒樣品經(jīng)9000r/min離心10min，取上清酒液測定花色苷和類黃酮含量，測定方法同1.3.1節(jié)。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

試驗均進行3次重復(fù)，結(jié)果利用Microsoft Excel軟件進行整理，使用SPSS11.0軟件進行Duncan’s新復(fù)極差法分析差異顯著性，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解條件對藍莓汁出汁率及SSC的影響

按照1.3.1節(jié)工藝制備藍莓汁，分別考察了酶種類、酶解溫度、酶解時間和加酶量對藍莓出汁率及SSC的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 酶解條件對藍莓出汁率（A）及可溶性固形物含量（B）的影響Fig.1 Effect of enzymatic conditions on juice yield(A)and soluble solid content(B)of blueberry

果膠酶可切裂并降解果肉中果膠的復(fù)雜分子，降低果汁中的果膠物質(zhì)鏈結(jié)構(gòu)，提高果汁出汁率[15]。由圖1可知，與不加酶相比，添加果膠酶、纖維素酶和果漿酶后的藍莓出汁率和SSC均顯著提高（P＜0.05）。出汁率及SSC含量在酶解溫度50℃、60℃、70℃之間不存在顯著性差異（P＞0.05），但均顯著高于40℃處理組（P＜0.05），60℃條件下果漿酶處理組的出汁率達到最高72.50%。隨著酶解時間和果漿酶添加量的增加，藍莓汁的出汁率及SSC先升高后趨于平緩。當(dāng)酶解時間為2.0 h時，藍莓出汁率達到72.35%，SSC為14.5%，然而繼續(xù)增加酶解時間至3.0 h時藍莓的出汁率與SSC均趨于平穩(wěn)，與2.0 h之間不存在顯著性差異（P＞0.05）。主要原因在于酶解的前期階段，在酶作用下藍莓組織及細胞壁被破壞，使藍莓的內(nèi)容物快速釋放，出汁率與SSC快速增加；而在酶解2.0 h后，細胞壁多糖基本已降解，細胞內(nèi)容物釋放完全，因此藍莓出汁率處于一個平衡值，如繼續(xù)增加酶解時間會對活性物質(zhì)造成損耗，也會增加生產(chǎn)成本。與對照相比，添加1‰果漿酶即可顯著提高藍莓汁SSC（P＜0.05），當(dāng)酶添加量＜3‰時，藍莓汁出汁率和SSC隨著酶量的增加而增加，酶添加量為3‰時，藍莓汁SSC增長至最高值。然而繼續(xù)增加酶添加量至5‰，藍莓出汁率趨于平穩(wěn)，與3‰處理組之間不具有差異性（P＞0.05），并且會導(dǎo)致SSC略低于3‰添加量，該結(jié)論與前人研究的結(jié)果類似[16-18]。綜上所述，藍莓汁最佳酶解工藝條件為果漿酶添加量3‰、酶解溫度60℃、酶解時間2.0 h，在此條件下藍莓出汁率為72.5%，SSC為14.5%。

2.2 酶解條件對藍莓汁花色苷及類黃酮含量的影響

藍莓果實中的花色苷及類黃酮含量豐富，果汁營養(yǎng)價值高。按照1.3.1節(jié)方法制備藍莓汁，測定不同酶解條件下藍莓汁的花色苷以及類黃酮含量，結(jié)果如圖2所示。

圖2 酶解條件對藍莓汁花色苷含量（A）及類黃酮含量（B）的影響Fig.2 Effects of enzymatic conditions on anthocyanins contents(A)and flavonoids contents(B)in blueberry juice

由圖2可知，果漿酶處理組的花色苷及類黃酮含量最高，分別為242.28 mg/100 mL和404.33 mg/100 mL，顯著高于對照組的156.57mg/100mL和353.96mg/100mL（P＜0.05）。酶的加入可以使細胞壁多糖解聚，破壞細胞壁結(jié)構(gòu)，提高出汁率，同時釋放結(jié)合態(tài)花色苷，有效提高了藍莓果中黃酮類和花色苷的釋放[19]。適當(dāng)溫度的熱處理可以提高花色苷的溶出率，抑制果汁中花色苷降解相關(guān)酶（過氧化物酶、多酚氧化酶等）的活性，從而減緩營養(yǎng)成分的損失[20]。但是，酶解溫度過高會對酶活性和藍莓果汁營養(yǎng)成分造成損失[17]。隨酶解溫度的升高，花色苷含量先增加，60℃處理達到最大值250.36 mg/100 mL，當(dāng)溫度增加至70℃時花色苷含量下降。而60℃條件下藍莓汁類黃酮物質(zhì)含量與70℃處理組之間不存在顯著性差異（P＞0.05）。與類黃酮相比，花色苷對溫度更為敏感，高溫處理會造成花色苷的熱分解。隨著酶解時間的增加，藍莓汁中花色苷和類黃酮含量先持續(xù)增加，到2.0h時達到最大值，繼續(xù)增加酶解時間花色苷含量趨于平穩(wěn)，類黃酮含量下降。酶的作用促使藍莓果肉組織和細胞壁結(jié)構(gòu)破壞，增加花色苷與類黃酮物質(zhì)的溶出率，酶解2.0h后這些具有生物活性的內(nèi)容物已基本溶出。藍莓汁中花色苷的含量隨果漿酶添加量的增加而增大，但當(dāng)添加量高于3‰后，花色苷含量的變化趨于平穩(wěn)，類黃酮含量具有相同的變化趨勢。這也與藍莓汁中有效成分的溶出率有關(guān)，由于酶解的反應(yīng)底物有限，酶量的增加對反應(yīng)產(chǎn)物的影響受限。LANDBOAK等[21]發(fā)現(xiàn)增加酶用量并沒有顯著提升果汁中的花色苷含量。綜上所述，藍莓汁最佳酶解工藝條件為果漿酶添加量3‰、酶解溫度60℃、酶解時間2.0h，在此條件下花色苷和類黃酮含量分別為250.36mg/100mL和408.10mg/100mL。2.3發(fā)酵工藝對藍莓酒花色苷及類黃酮含量的影響2.3.1發(fā)酵溫度對藍莓酒花色苷及類黃酮的影響

由圖3可以看出，隨著發(fā)酵反應(yīng)的啟動，藍莓酒液中的花色苷與類黃酮物質(zhì)顯著增加（P＜0.05），第2天達到峰值，之后呈現(xiàn)下降趨勢。主發(fā)酵期間花色苷降解較快，從第2天的峰值247.34 mg/100 mL降至第8天的130.85 mg/100 mL，含量下降47.1%。在第10天過濾后，酒液中花色苷含量較為穩(wěn)定。藍莓酒中花色苷含量在發(fā)酵前期的快速下降主要是因為酵母對色素有一定的吸附作用，以及微生物產(chǎn)生的酶促作用的影響，而發(fā)酵后期的緩慢降低可能主要是單寧類物質(zhì)和花色苷的聚合作用[22]。發(fā)酵第2天30℃發(fā)酵的藍莓酒花色苷物質(zhì)含量高于其他2個溫度條件下的藍莓酒，是因為發(fā)酵初期30℃環(huán)境下酵母生長活躍，藍莓果肉細胞組織被迅速破壞，增加內(nèi)容物質(zhì)的溶出率。發(fā)酵第4天后，30℃發(fā)酵藍莓酒花色苷含量低于20℃與25℃發(fā)酵藍莓酒，一是因為高溫條件下酵母生長速度較快，迅速進入衰亡期，不能在發(fā)酵后期將發(fā)酵液中的糖有效轉(zhuǎn)化成酒精，降低藍莓酒酒精度，藍莓花色苷物質(zhì)的溶出速度減緩；另一方面持續(xù)的高溫環(huán)境可能造成花色苷物質(zhì)的降解。低溫條件下發(fā)酵果酒中花色苷含量顯著高于高溫條件下發(fā)酵的藍莓酒（P＜0.05），這一結(jié)論與雷霽卿等[23]的報道相同。

圖3 溫度對藍莓酒花色苷含量（A）及類黃酮含量（B）的影響Fig.3 Effect of temperature on anthocyanins contents(A)and flavonoids contents(B)in blueberry wine

在發(fā)酵過程中，藍莓酒類黃酮含量整體呈上升趨勢，從發(fā)酵起始的398.58 mg/100 mL增加至超過500 mg/100 mL。酵母菌在發(fā)酵時，乙醇濃度增加，因游離的黃酮類化合物更易溶于乙醇等有機溶劑中，加大了黃酮類化合物浸出率。但由于不同發(fā)酵時間乙醇濃度的上升幅度不同，造成了總黃酮變化幅度的不同。類黃酮物質(zhì)較花色苷更穩(wěn)定，降解速率較慢。在發(fā)酵前期，由于高溫條件酵母生長較快，發(fā)酵啟動迅速，藍莓酒中乙醇含量較高，溶出的類黃酮物質(zhì)較高。但是從第13天開始30℃條件下的藍莓酒中類黃酮物質(zhì)低于25℃和20℃條件組，且25℃組的類黃酮物質(zhì)含量高于20℃條件組?？赡芤驗榈?0天將酒過濾后，藍莓酒中類黃酮物質(zhì)的保留受溫度的影響更為明顯。此外，較低溫度的發(fā)酵條件可能會使生產(chǎn)類黃酮等多酚類物質(zhì)的酶體系發(fā)生上調(diào)，產(chǎn)生更多的多酚類物質(zhì)。綜上，藍莓酒發(fā)酵最佳溫度為25℃。

2.3.2 接菌量對藍莓酒花色苷及類黃酮的影響

由圖4可知，不同接菌量條件下，藍莓酒中花色苷含量變化趨勢基本一致。發(fā)酵初期藍莓酒中花色苷含量明顯增加，接菌量4%和6%的藍莓酒中花色苷含量最高值出現(xiàn)在發(fā)酵的第2天，接菌量2%組花色苷含量的峰值出現(xiàn)在第3天。發(fā)酵第6天起，接菌量6%的藍莓酒中花色苷含量低于其他2組。而類黃酮含量在接菌量4%藍莓酒發(fā)酵過程中一直高于其他2個接菌量組。接菌量與發(fā)酵周期有直接關(guān)系，接菌量小，發(fā)酵初期酵母繁殖緩慢，發(fā)酵速度慢、周期延長，發(fā)酵不充分，酒精度低，花色苷和類黃酮物質(zhì)溶出率低[17]。接菌量大，發(fā)酵啟動速度快，但是接種量過多，發(fā)酵培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)多消耗在菌體細胞的生長繁殖上，有限的營養(yǎng)物質(zhì)不能滿足酵母生長代謝繁殖，酵母殘體產(chǎn)生酵母異味，覆蓋藍莓的酒香及澄清度，從而影響果酒的口感、風(fēng)味，且容易導(dǎo)致花色苷迅速降解，引起果酒色澤和營養(yǎng)價值的降低[23]。因此，藍莓酒發(fā)酵最佳接菌量為4%。

圖4 接菌量對藍莓酒花色苷含量（A）及類黃酮含量（B）的影響Fig.4 Effect of inoculum on anthocyanins contents(A)and flavonoids contents(B)in blueberry wine

2.3.3 初始糖量對藍莓酒花色苷及類黃酮的影響

果酒釀制過程本質(zhì)上是一個微生物通過糖酵解途徑將葡萄糖和果糖代謝產(chǎn)生乙醇的過程，因此原料的糖含量和種類直接影響果酒的酒精產(chǎn)量和果酒品質(zhì)。初始糖度主要為酵母菌生長繁殖提供碳源，糖度過低，酵母生長代謝所需的營養(yǎng)得不到滿足，生長代謝較慢，不能徹底發(fā)酵，產(chǎn)生酒精度過低；糖量過高則會抑制酵母生長及合成代謝產(chǎn)物能力、延長發(fā)酵時間、同時影響組織中有效成分的溶出[17]。在相同發(fā)酵條件下，分別在藍莓果漿加入0、5%和10%的白砂糖，研究不同起始糖含量對藍莓酒品質(zhì)的影響，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，加入外源糖的藍莓酒中花色苷與類黃酮含量均明顯低于純藍莓漿釀制的果酒（P＜0.05），并且10%加糖量藍莓酒花色苷和類黃酮含量低于5%加糖量組?？紤]到GB/T 32783—2016《藍莓酒》中要求酒精度≥5%vol，本研究中藍莓的初始糖度可滿足要求，故選擇發(fā)酵初期不添加外源糖制得的藍莓酒最佳。

圖5 加糖量對藍莓酒花色苷含量（A）及類黃酮含量（B）的影響Fig.5 Effect of sugar addition on anthocyanins contents(A)and flavonoids contents(B)in blueberry wine

3 結(jié)論

以藍莓加工主導(dǎo)產(chǎn)品藍莓汁和藍莓酒為研究對象，測定了不同工藝條件下藍莓汁、藍莓酒中花色苷、類黃酮物質(zhì)的變化規(guī)律。在藍莓果漿中加入3‰果漿酶，60℃酶解2 h，可以顯著提高藍莓汁中花色苷及類黃酮物質(zhì)的含量。在藍莓酒發(fā)酵過程中，花色苷呈現(xiàn)持續(xù)減少的趨勢，而類黃酮含量緩中有增。發(fā)酵初期以藍莓漿為原料（SSC14.5%），在接菌量4%、25℃進行發(fā)酵和陳釀更有利于維持藍莓酒中花色苷和類黃酮物質(zhì)含量。發(fā)酵初期添加外源糖使得花色苷物質(zhì)和類黃酮物質(zhì)減少，生產(chǎn)中可以在發(fā)酵中期補糖，選擇合適的糖種類并盡量控制外源糖的添加量。