張曉龍，劉 燕，曹 冉，朱文眾*

（1.河北科技大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.河北省環(huán)保產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，河北 石家莊 050091）

酒糟別名紅糟、酒醅糟、扔糟等，是米、麥、高梁等原料釀酒后剩余的殘渣。通常情況下白酒與酒糟的對應(yīng)產(chǎn)量比為1∶3，據(jù)中國產(chǎn)業(yè)信息網(wǎng)統(tǒng)計分析，2016年、2017年，我國白酒的總產(chǎn)量分別達(dá)到1 358.4千萬升和1 341.9千萬升[1]，我國白酒行業(yè)每年有大量丟糟產(chǎn)生，丟糟的綜合利用意義重大[2]。鮮酒糟的含水量約占總體含量的60%以上，其蛋白質(zhì)和淀粉等的含量也相對較高，酒糟中的殘余淀粉一般是指游離的含α-1,6糖苷鍵的淀粉和纖維素包裹的淀粉，難以被傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵所利用。研究表明，扔糟中含有豐富的白酒香氣物質(zhì)和前體物質(zhì)，包括有機酸、醇類、酯類、含氮化合物等[3]，國內(nèi)學(xué)者對白酒酒糟的研究主要集中在酒糟中淀粉再利用、纖維素的提取、以及菌種的篩選[4-5]，其中左上春等[6]綜述了近年來我國白酒酒糟資源化利用的主要進(jìn)展，包括生產(chǎn)飼料、培養(yǎng)食用菌、提取高附加值產(chǎn)物、釀醋、生產(chǎn)能源和有機酸等，討論酒糟資源化過程中存在的問題并展望后期發(fā)展的方向。

本實驗針對扔糟中殘余淀粉的結(jié)構(gòu)組成，在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法[7-8]優(yōu)化糖化酶[9]、纖維素酶[10-11]、普魯蘭酶[12-13]酶制劑處理扔糟制備白酒工藝條件，使其中的粗淀粉水解為還原糖，接種酵母進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵[14]產(chǎn)生酒精，以提高扔糟淀粉出酒率[15]。扔糟的再次發(fā)酵，節(jié)約了資源，一定程度上提高了衡水老白干釀酒工藝中的淀粉出酒率，具有一定的現(xiàn)實意義，并為酶制劑在白酒生產(chǎn)上的應(yīng)用提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品來源

白酒扔糟：河北衡水老白干酒業(yè)股份有限公司。

1.1.2 主要試劑

糖化酶（酶活1萬U/g）、纖維素酶（酶活5萬U/g）：北京索萊寶科技有限公司；P2000型普魯蘭酶（酶活2 000 U/mL）：寧夏夏盛實業(yè)集團有限公司；釀酒高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

7200型分光光度計：上海天美科學(xué)儀器有限公司；PL203電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；高溫蒸汽滅菌鍋：上海博訊實業(yè)有限公司；800型離心機：上海手術(shù)器械廠；25mL附溫比重瓶：上海信誼儀器廠有限公司。

1.3 方法

1.3.1 扔糟制備白酒工藝流程及操作要點

操作要點：

扔糟在121℃、30 min條件下濕法滅菌[16]，添加酶制劑（糖化酶、纖維素酶、普魯蘭酶添加量），在47℃下糖化48 h，添加0.05%活性干酵母用去離子水常溫下活化15 min，調(diào)節(jié)溫度至25℃，發(fā)酵15 d。取100 g酒醅加水蒸餾100 mL原酒液測定酒精度為3.06%vol。

1.3.2 扔糟基本成分分析檢測

含水量的測定采用GB 5009.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測定》中的減壓干燥法[17]；酒精度的測定采用GB5009.225—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)酒中乙醇濃度的測定》中密度瓶法[18]；粗淀粉（總糖）及游離還原糖含量的測定采用DNS比色法[19-20]。扔糟淀粉水解率、出酒率計算公式如下：

式中：Y—扔糟中游離還原糖含量，mg/100 g（以濕基計，下同）；0.9—還原糖與淀粉折算系數(shù)；693.36—扔糟中初始還原糖含量，mg/100 g；M—扔糟質(zhì)量，g；0.095—扔糟粗淀粉含量系數(shù)。

式中：V—折合成65%vol原酒體積，mL；M—扔糟質(zhì)量，g；0.897—65%vol原酒密度，g/mL，0.095—扔糟粗淀粉含量系數(shù)。

1.3.3 糖化工藝優(yōu)化單因素試驗

以還原糖含量為評價指標(biāo)，分別考察溫度（15℃、25℃、35 ℃、45 ℃、55 ℃）、時間（12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h）、pH值（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0）、糖化酶添加量（0.20%、0.40%、0.60%、0.80%、1.00%、1.50%、2.00%）、纖維素酶添加量（0.30%、0.60%、0.90%、1.20%、1.50%、1.80%）、普魯蘭酶添加量（0.30%、0.60%、0.90%、1.20%、1.50%、1.80%）對糖化工藝的影響。

1.3.4 糖化工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗

根據(jù)單因素試驗，確定各因素優(yōu)化水平，以扔糟中游離還原糖含量作為響應(yīng)值，利用Design Expert軟件中Box-Behnken Design進(jìn)行響應(yīng)面試驗設(shè)計，因素與水平編碼值見表1。

表1 響應(yīng)面試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments design

2 結(jié)果與分析

2.1 扔糟基本成分測定結(jié)果

對衡水老白干釀酒工藝中各環(huán)節(jié)酒醅基本成分進(jìn)行測定，結(jié)果見表2。由表2可知，衡水老白干釀酒扔糟中含水分64.4%、淀粉9.50%、還原糖693 mg/100 g，pH值3.12。

表2 衡水老白干酒醅參數(shù)Table 2 Parameters of Hengshui Laobaigan fermented grains

2.2 糖化工藝優(yōu)化單因素試驗

2.2.1 作用溫度對扔糟糖化工藝條件的影響

在時間48 h，pH 4.0，糖化酶添加量1.00%，纖維素酶添加量1.20%，普魯蘭酶添加量0.90%條件下，考察不同作用溫度對糖化工藝的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 作用溫度對扔糟還原糖含量的影響Fig.1 Effect of reaction temperature on reducing sugar content of distiller's grains

從圖1可以看出，作用溫度15～45℃區(qū)間扔糟中還原糖含量由1733mg/100g增至3556mg/100g；作用溫度為45～55℃條件下，還原糖含量穩(wěn)定在3 500 mg/100 g左右，數(shù)值變化不大，糖化效果趨于穩(wěn)定；作用溫度為45℃時，還原糖含量最大，為3556mg/100g。因此，作用溫度選用45℃為宜。

2.2.2 作用時間對扔糟糖化工藝條件的影響

在作用溫度45℃，pH 4.0，糖化酶添加量1.00%，纖維素酶添加量1.20%，普魯蘭酶添加量0.90%條件下，考察不同作用時間對糖化工藝的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 作用時間對扔糟還原糖含量的影響Fig.2 Effect of reaction time on reducing sugar content of distiller's grains

從圖2可以看出，在作用時間為12～48 h內(nèi)，扔糟中還原糖含量由2 589 mg/100 g上升至4 342 mg/100 g；作用時間為48 h時，還原糖含量最大，為4 342 mg/100 g；作用時間＞48 h后，扔糟中還原糖含量穩(wěn)定在4 300 mg/100 g，糖化效果趨于穩(wěn)定。因此，作用時間選擇48 h為宜。

2.2.3 pH值對扔糟糖化工藝條件的影響

在作用溫度45℃，作用時間48 h，糖化酶添加量1.00%，纖維素酶添加量1.20%，普魯蘭酶添加量0.90%條件下，考察不同pH值對糖化工藝的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 pH值對扔糟還原糖含量的影響Fig.3 Effect of pH value on reducing sugar content of distiller's grains

從圖3可以看出，當(dāng)pH在3.0～4.0時，還原糖含量由2 875 mg/100 g增至4 019 mg/100 g；當(dāng)pH值為4.0時，還原糖含量最大，為4019mg/100g，扔糟糖化效果最好；當(dāng)pH＞4.0之后，還原糖含量有所下降。由于扔糟中有復(fù)雜的緩沖系統(tǒng)，試驗中難以對扔糟pH進(jìn)行精確控制，采用pH 4.0作為固定水平。

2.2.4 糖化酶添加量對扔糟糖化工藝條件的影響

在溫度45℃，時間48h，pH 4.0，纖維素酶添加量1.20%，普魯蘭酶添加量0.90%條件下，考察不同糖化酶添加量對糖化工藝的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 糖化酶添加量對扔糟還原糖含量的影響Fig.4 Effect of glucoamylase addition on reducing sugar content of distiller's grains

從圖4可以看出，在糖化酶添加量為0.20%～1.00%時，扔糟中還原糖含量由3688mg/100g增至4357mg/100g；在糖化酶添加量為1.00%時，還原糖含量最大，為4357mg/100g；在糖化酶添加量＞1.00%之后，還原糖含量穩(wěn)定在4300mg/100g，糖化效果趨于穩(wěn)定。因此，糖化酶添加量選擇1.00%為宜。

2.2.5 纖維素酶添加量對扔糟糖化工藝條件的影響

在溫度45℃，時間48 h，pH 4.0，糖化酶添加量1.00%，普魯蘭酶添加量0.90%條件下，考察不同纖維素酶添加量對糖化工藝的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 纖維素酶添加量對扔糟還原糖含量的影響Fig.5 Effect of cellulase addition on reducing sugar content of distiller's grains

從圖5可以看出，在纖維素酶添加量在0.30%～1.20%時，扔糟中還原糖含量由3703mg/100g增至4334mg/100g；在纖維素酶添加量為1.20%時，還原糖含量最大，為4334mg/100g；在纖維素酶添加量＞1.20%之后，糖化效果趨于穩(wěn)定。因此，纖維素酶添加量選擇1.20%為宜。

2.2.6 普魯蘭酶添加量對扔糟糖化工藝條件的影響

在溫度45℃，時間48 h，pH 4.0，糖化酶添加量1.00%，纖維素酶添加量1.20%條件下，考察不同普魯蘭酶添加量對糖化工藝的影響，結(jié)果見圖6。

圖6 普魯蘭酶添加量對扔糟還原糖含量的影響Fig.6 Effect of pullulanase addition on reducing sugar content of distiller's grains

從圖6可以看出，在普魯蘭酶添加量為0.30%～0.90%時，扔糟中還原糖含量由3310mg/100g增至4133mg/100g；在普魯蘭酶添加量為0.90%時，還原糖含量最大，為4133mg/100g；普魯蘭酶添加量＞0.90%之后，糖化效果趨于穩(wěn)定。因此，普魯蘭酶添加量選擇0.90%為宜。

2.3 扔糟糖化工藝條件的優(yōu)化

2.3.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

根據(jù)單因素試驗，以扔糟中游離還原糖含量（Y）作為響應(yīng)值，對糖化工藝中作用溫度（A），作用時間（B），糖化酶添加量（C），纖維素酶添加量（D）及普魯蘭酶添加量（E）進(jìn)行研究，利用Box-Behnken Design進(jìn)行響應(yīng)面試驗設(shè)計，試驗設(shè)計及結(jié)果見表3，回歸模型方差分析見表4。

續(xù)表

表4 回歸模型的方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

運用Design Expert 8.0.6軟件響應(yīng)面分析程序?qū)Ρ?結(jié)果進(jìn)行回歸分析，得到以扔糟中還原糖含量為響應(yīng)函數(shù)，各參數(shù)編碼值的二次多項回歸方程：

由表4可知，可以得出本試驗的二次多項模型顯示極顯著性（P＜0.01），失擬項不顯著（P＞0.05），回歸方程決定系數(shù)R2=0.9954，表示該模型可以解釋99.54%的響應(yīng)值變化，方程擬合程度較好，可以用作扔糟中淀粉水解進(jìn)行分析和預(yù)測。

在回歸方程中一次項與二次項對響應(yīng)值影響均極顯著（P＜0.01）；交互項中，作用溫度和纖維素酶、纖維素酶和普魯蘭酶對響應(yīng)值影響不顯著（P＞0.05）外，作用時間和糖化酶對響應(yīng)值影響顯著（P＜0.05），其他交互項對響應(yīng)值影響極顯著（P＜0.01）。

2.3.2 響應(yīng)面分析與優(yōu)化

為考察各因素在交互項上對扔糟中淀粉水解效果的影響，利用Design-Expert 8.06分析軟件對回歸方程進(jìn)行運算，得出各因素交互項的響應(yīng)面及等高線圖，結(jié)果見圖7。

圖7 各因素間交互作用對扔糟還原糖含量影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.7 Response surface plots and contour line of interaction between factors on reducing sugar content of distiller's grains

從圖7中可以看出，各因素間兩兩交互項對響應(yīng)值扔糟中還原糖含量的影響，對試驗結(jié)果以及回歸方程進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化分析，得到糖化的最優(yōu)條件：作用溫度47.41℃、作用時間48.59 h、糖化酶添加量1.01%，纖維素酶添加量1.26%，普魯蘭酶添加量0.95%。為了便于實際操作，將該最優(yōu)條件修正為作用溫度47℃、作用時間49 h、糖化酶添加量1.0%，纖維素酶添加量1.3%，普魯蘭酶添加量1.0%，在此最優(yōu)條件下，扔糟中還原糖凈生成量為4 564.14 mg/100 g，扔糟中淀粉水解率為49.8%。

2.4 驗證試驗

2.4.1 扔糟糖化效果驗證試驗

根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化得到各因素最佳參數(shù)，為驗證優(yōu)化結(jié)果，進(jìn)行了3次平行試驗，結(jié)果見表5。

表5 最佳條件下扔糟各項參數(shù)Table 5 Parameters of distiller's grains at the optimal conditions

由表5可知，在此最佳糖化工藝條件下，實際扔糟中還原糖凈生成量平均值為4 556.11 mg/100 g，酶制劑處理過的扔糟淀粉水解率平均值可達(dá)49.7%，本研究得到的還原糖含量相對于理論數(shù)據(jù)誤差為0.2%，驗證了回歸方程的有效性，為開發(fā)利用扔糟中殘余淀粉提供理論指導(dǎo)。

2.4.2 發(fā)酵驗證試驗

為進(jìn)一步驗證白酒扔糟的糖化效果，進(jìn)行接種發(fā)酵試驗，設(shè)置空試驗組分別添加0.05%酵母（1#）、0.05%糖化酶（2#），復(fù)合酶制劑（糖化酶添加量1.01%，纖維素酶添加量1.26%，普魯蘭酶添加量0.95%）（3#），25℃條件下固態(tài)發(fā)酵15 d，結(jié)果見表6。

表6 發(fā)酵試驗結(jié)果Table 6 Results of fermentation experiments

從表6可以看出，在扔糟中仍含有少量可以被釀酒酵母利用的淀粉，1#、2#組酒精度分別為0.52%vol、1.45%vol，淀粉出酒率分別為7.4%、21.5%，說明釀酒酵母糖化能力低于單一糖化酶制劑。3#組酒精度為3.06%vol，淀粉出酒率達(dá)44.5%，證明扔糟含有較多α-1,6-糖苷鍵淀粉，糖化酶和酵母難以降解，復(fù)合酶制劑可以降解被酵母利用，說明復(fù)合酶制劑的協(xié)同作用效率很高，對扔糟中淀粉的水解影響明顯。對于扔糟發(fā)酵而言，復(fù)合酶制劑可以大幅提高扔糟淀粉出酒率，復(fù)合酶制劑高于單一酶制劑對白酒扔糟的糖化效果。

3 結(jié)論

本研究采用響應(yīng)面分析得出復(fù)合酶制劑協(xié)同作用于白酒扔糟最佳糖化條件：糖化酶1.0%、纖維素酶1.3%、普魯蘭酶1.0%、作用溫度47℃、作用時間49 h，pH 4.0，在最優(yōu)糖化條件下，扔糟中還原糖含量4 564.14 mg/100g，扔糟中淀粉水解率49.8%。并在此條件下，進(jìn)行接種發(fā)酵試驗，結(jié)果表明，相較于單一酶制劑處理扔糟的發(fā)酵工藝，由復(fù)合酶制劑處理后扔糟的淀粉出酒率提高了23.0%，作用效果明顯。扔糟二次發(fā)酵，一定程度上提高了衡水老白干釀酒工藝中的淀粉出酒率。

由于扔糟中含有較多白酒香味物質(zhì)或前體物質(zhì)，酯類是白酒香味物質(zhì)的重要組成部分，它是由乙醇和有機酸通過酯化作用形成的，本實驗將扔糟中殘余淀粉轉(zhuǎn)化為一定量的乙醇，為進(jìn)一步探索扔糟中酯類物質(zhì)的催化合成和提取奠定了基礎(chǔ)。