郭妍妍， 趙丁丁， 孫丙耀

(蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，江蘇蘇州 215123)

水稻作為主要的糧食作物和分子生物學(xué)(單子葉植物)研究的模式植物，隨著其全基因組序列的公布[1]，尋找和認(rèn)識新型水稻功能基因已經(jīng)成為水稻功能基因組學(xué)的重要研究任務(wù)。通過構(gòu)建突變體庫，以突變基因?yàn)檠芯繉ο蠓治鏊净蚬δ?，是一條有效的研究捷徑。產(chǎn)生水稻突變體的方法主要有T-DNA插入、理化誘變、轉(zhuǎn)座子插入等[2-7]。其中，利用Ac/Ds插入產(chǎn)生水稻突變體，并以TAIL-PCR技術(shù)克隆突變位點(diǎn)側(cè)翼序列尋找功能基因得到了廣泛應(yīng)用。國內(nèi)外許多研究單位構(gòu)建了多個水稻Ac/Ds突變體庫，也從中分離到一些控制不同水稻性狀的基因[2-6]。矮稈作為重要的農(nóng)藝性狀，矮稈基因的發(fā)現(xiàn)、研究和利用在“綠色革命”中起到至關(guān)重要的作用。但是目前為止，能夠在生產(chǎn)上實(shí)際應(yīng)用的矮稈主基因只有sd-1。植物矮化常與赤霉素(GA)、油菜素類固醇(BR)的代謝有關(guān)[8-10]。GA是植物生長發(fā)育過程中一類重要的調(diào)節(jié)激素，對誘導(dǎo)α-淀粉酶的形成、莖的伸長和植株增高、節(jié)間和葉片的伸長、禾谷類種子的萌發(fā)、花器官的形成等都具有明顯的促進(jìn)作用。目前，已有136種GA在植物、真菌、細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)(http：//www.plant-hormones.info/gibberellins.htm)。GA的合成需要3種基本酶：GA2氧化酶、GA3氧化酶和GA20氧化酶。這3種酶都具有保守的2OG-Fe(Ⅱ)加氧酶蛋白結(jié)構(gòu)域，屬于2OG-Fe(Ⅱ)加氧酶蛋白超家族[11-14]。Lo等在水稻TRIM群中發(fā)現(xiàn)的GA2氧化酶6，也具有保守的2OG-Fe(Ⅱ)結(jié)構(gòu)域[15]；Teng等在研究玉米第3號染色體上的GA3氧化酶2時，發(fā)現(xiàn)它是一個對玉米株高起主效作用的數(shù)量性狀基因座，編碼GA3-β羥化酶，與水稻GA3氧化酶2的同源性非常高[16]。尋找和發(fā)現(xiàn)新的能在生產(chǎn)上利用的矮稈資源以及研究矮生相關(guān)機(jī)制是水稻分子遺傳工作者的不斷追求。本研究利用已構(gòu)建的Ac/Ds突變體系，篩選到矮稈表型突變體(mutant type，MT)，并且在矮稈突變體后代培育中出現(xiàn)株高回復(fù)突變植株(revertant type，RT)。由此，展開對未知矮稈基因的分子研究。希望通過對MT、RT株高控制基因的研究，揭示此未知基因的結(jié)構(gòu)和功能。

1 材料與方法

1.1 水稻材料

試驗(yàn)材料來源于水稻品種Dongjin(OryzasativaL. var.japonicacv. Dongjin)的Ac/Ds插入突變株系[17](由韓國國立慶尚大學(xué)Han Chang-deok教授實(shí)驗(yàn)室提供)，經(jīng)過連續(xù)4代自交培育出現(xiàn)MT，MT后代自交培育，出現(xiàn)RT。本試驗(yàn)以MT、RT作為試驗(yàn)材料。

1.2 引物設(shè)計(jì)

采用PCR方法檢測Ac、Ds在水稻基因組上可能的插入，根據(jù)Ac、Ds的序列特點(diǎn)設(shè)計(jì)1對特異引物P1、P2，同時使用GUSBYF、GUSBYR作驗(yàn)證。TAIL-PCR引物：Ds序列的3個特異引物SP1、SP2、SP3，分別與隨機(jī)簡并引物AD組成3對引物，用于TAIL-PCR的3個反應(yīng)，擴(kuò)增Ds插入位點(diǎn)側(cè)翼序列。Ds插入基因型分析引物：根據(jù)插入位點(diǎn)水稻序列特點(diǎn)設(shè)計(jì)特異引物F1、R1；利用前述引物SP3與R1組成1對引物，檢測Ds插入，從而分析Ds插入基因型(表1)。

1.3 基因組DNA的提取和Ds插入的PCR鑒定

基因組DNA的提取依照Sun等的方法[18]進(jìn)行。

Ds插入的PCR鑒定：建立PCR反應(yīng)體系，選擇特異引物P1、P2，94 ℃變性30 s， 58 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸2 min，35個循環(huán)，檢測有無Ac/Ds插入。同時，對GUS報(bào)告基因進(jìn)行PCR鑒定，再次驗(yàn)證有無Ac/Ds插入。

表1 PCR反應(yīng)引物

1.4 Ds側(cè)翼序列的TAIL-PCR分析

對含Ac/Ds雙元件的樣品進(jìn)行TAIL-PCR分析[18]：TAIL-PCR反應(yīng)體系涉及的第1、第2、第3反應(yīng)所采用的特異引物分別為SP1、SP2、SP3，隨機(jī)簡并引物為AD。反應(yīng)結(jié)束后將第2、3輪反應(yīng)的產(chǎn)物依次上樣于2%瓊脂糖凝膠電泳以選擇遷移條帶。

特異條帶的洗脫、純化和Ds側(cè)翼序列的測定：根據(jù)所設(shè)計(jì)的特異引物SP2、SP3在Ds序列上的間隔(36 bp)選擇第2、3輪反應(yīng)產(chǎn)物中的特異遷移條帶。從凝膠中切出第3反應(yīng)的條帶，回收純化，TA克隆測序。

1.5 Ds側(cè)翼序列的GenBank檢索和插入位點(diǎn)的基因分析

為分析Ds插入部位的水稻基因情況，將上述已測的Ds側(cè)翼序列用NCBI的Blast進(jìn)行在線檢索(http：//www.ncbi.nih.gov/BLAST/)，確認(rèn)Ac/Ds插入植株中Ds的染色體定位和插入部位水稻基因結(jié)構(gòu)和編碼氨基酸序列。同時，利用FGENESH(http：//www.softberry.com/)和GeneMark.hmm(http：//opal.biology.gatech.edu/)推測殘留8個堿基足跡后的被插入基因的結(jié)構(gòu)，獲得其編碼的氨基酸序列。

1.6 RT中Ds跳躍行為的分子驗(yàn)證

Ds的跳躍往往會留下8～11個堿基的足跡。設(shè)計(jì)特異引物F1和R1進(jìn)行PCR反應(yīng)，對擴(kuò)增條帶克隆測序，即可驗(yàn)證有無足跡殘留。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻突變體主要表型差異

從圖1可以看出，株高突變體系MT、RT和野生型(wild type，WT)對照，表型差異主要表現(xiàn)在株高和旗葉傾角上。WT平均株高79.02 cm，旗葉傾角25.3°；MT平均株高 45.86 cm(野生型的58.04%)，旗葉傾角75.6°；RT平均株高74.13 cm(野生型的93.81%)，旗葉傾角44.1°(圖1-a、圖1-b)。另外，RT在回復(fù)株高的同時，出現(xiàn)1個新性狀，穎殼上出現(xiàn)雜斑(圖1-c)。根據(jù)水稻前4～5莖節(jié)長度比例的差異，Takeda將水稻矮稈突變體分為6類[19](圖1-d)。本研究中，MT和RT均屬于dn型突變體(圖1-e)。

2.2 PCR分析Ac/Ds在水稻基因組上的插入

本研究根據(jù)Ac、Ds元件的核酸序列特點(diǎn)設(shè)計(jì)1對特異引物，以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分析基因組上是否存在Ac和Ds元件。圖2-a為采用特異引物P1、P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果，其中，擴(kuò)增出約0.4 kb特異條帶的表明基因組中含Ac元件；擴(kuò)增出約0.5 kb條帶的表明含有Ds元件?？梢?，MT和RT基因組中均有Ac/Ds雙元件。圖2-b為GUS驗(yàn)證，即根據(jù)Ac/Ds雙元件上含有的GUS報(bào)告基因，設(shè)計(jì)特異引物PCR擴(kuò)增，進(jìn)一步驗(yàn)證了MT和RT均有Ac/Ds雙元件插入。

2.3 Ds側(cè)翼序列的TAIL-PCR分析

對經(jīng)上述Ac/Ds插入分析證實(shí)含Ac/Ds轉(zhuǎn)座元件的MT、RT進(jìn)行TAIL-PCR，擴(kuò)增Ds插入位點(diǎn)側(cè)翼序列，選擇“*”標(biāo)示序列凝膠回收(圖3)，純化后將該片段連接到T載體上，經(jīng)轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α、藍(lán)白斑篩選、菌液PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，再進(jìn)行序列測定。

2.4 Ds側(cè)翼序列的GenBank檢索和水稻Ds插入位點(diǎn)的分析

將上述測得的Ds側(cè)翼序列的核苷酸序列用NCBI的Blast軟件進(jìn)行在線檢索，發(fā)現(xiàn)Ds插入在水稻第3號染色體上，具體基因?yàn)镺s03g0147400(Oryzasativajaponicagroup)，在其第3外顯子上，序列ID為BAS82290.1(圖4)。此基因編碼假擬氧化還原酶蛋白[19-20]，含有1個保守的2OG-Fe(Ⅱ)加氧酶結(jié)構(gòu)域，屬于2OG-Fe(Ⅱ)加氧酶蛋白超家族。該假擬氧化還原酶蛋白擁有469個氨基酸。

2.5 Ds跳躍行為

根據(jù)Ds插入位點(diǎn)旁側(cè)水稻序列特點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物F1和R1，PCR擴(kuò)增、克隆測序發(fā)現(xiàn)RT中有Ds轉(zhuǎn)座跳躍，并殘留“CATCATGA”8個堿基的足跡。插入位點(diǎn)水稻部分側(cè)翼序列：5′-G A C C A G G A G G C T T T G G T T G G C G C C T T T A G G G A T A A A -C A G C A G A G C A T G G C C A T A C A C C A C T A C C C T C C T T G C C G C C A C -C C A G A C A A G G T G A T C G G C A T C A C G C C G C A C T C C G A T G G T C T C G- G C C T G A C G C T G C T G C T G C A G C T C G A C G A C A C G C C C G G C C T G C- A G A T C A G G A A G G A T G G C A G G T G G T T A C C A G T G C G A C C T C G C -C C G G G C A C C T (Ds插入位點(diǎn))T C A T C A T G A C A T C A T C A A T G T- C G C C G A C A T A C T C G A G G T C C T T A C C A A T G G C G C G T A C A A G A G- C G T C G A G C A C A G A G T A C T C G C G G A C G C A G A G A A A G G C C G A A- C C A C C A T C G T G A C A T T T C A T G A A G C C T A T G T C G A T G G A A T G G- T G A A G C C G A T C C C G G A G G T G C T C A A G C T C A A C G G A G C A G A G G- C A C G C T A C A A G T C C A T A G A A A G A A T T G A G T A T A T C A A G G G A A- A C T T T G T G G C G C T T T C T G A G G G G A C A C G A T T T C T G G A G A G C C- T T A A G A T A T A G -3′，方框標(biāo)記的8個堿基即為殘留足跡。

本研究中RT的轉(zhuǎn)座機(jī)制屬于“內(nèi)切酶模式”[7，21-24]。由圖5可知，首先核酸外切酶延5′→3′的方向，切斷水稻序列，Ds得以插入；同時在基因修復(fù)機(jī)制下，堿基互補(bǔ)配對，空缺堿基得以補(bǔ)全，從而多出8個堿基對；接著Ac提供轉(zhuǎn)座酶，幫助Ds切離(本研究材料Ds在切離的同時帶走2個旁側(cè)堿基，屬于“不干凈”切離)；伴隨Ds的切離，基因序列按5′→3′方向自發(fā)延伸，從而形成2個發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)，這就需要內(nèi)切酶的參與，內(nèi)切酶在一定范圍內(nèi)以一定幾率切割“發(fā)夾環(huán)”的不同位點(diǎn)，導(dǎo)致環(huán)結(jié)構(gòu)的消除；DNA重新合成、修復(fù)，結(jié)果產(chǎn)生不同長度和排列的足跡。本研究材料中，內(nèi)切酶在貢獻(xiàn)位點(diǎn)的下一個堿基處切割，修復(fù)完成后，出現(xiàn)2個堿基對的顛換。與野生型相比，Ds跳躍的結(jié)果是殘留8個堿基，并伴有1個(實(shí)際2個)堿基對的轉(zhuǎn)換。

3 討論與結(jié)論

由于Ds的插入導(dǎo)致編碼假擬氧化還原酶蛋白的基因正常功能改變，出現(xiàn)矮稈突變體(MT)。這種改變有2種可能：(1)Ds參與蛋白表達(dá)。Ds可參與該基因(也可能是其他基因)的正常表達(dá)，兩者形成一種“新的”基因；因?yàn)镈s條帶的加入導(dǎo)致原有氨基酸鏈的增加或改變其折疊結(jié)構(gòu)等，產(chǎn)生一種新的蛋白，最終導(dǎo)致原來基因功能的改變。這種蛋白可能參與到水稻生理作用，也可能被其他酶降解，沒有發(fā)揮作用。(2)Ds不參與表達(dá)。只是因?yàn)殚L達(dá)4.6 kb的Ds核苷酸鏈的插入導(dǎo)致該基因表達(dá)的中斷，使其喪失正常表達(dá)功能，合成出其他有用或無用的蛋白。也可能因?yàn)镈s的插入，影響附近DNA鏈的空間結(jié)構(gòu)，從而鏈?zhǔn)接绊懙街車嚓P(guān)基因的表達(dá)，產(chǎn)生突變體MT?？傊?，不管哪種可能，都會改變該基因原有功能，導(dǎo)致該基因無法正常編碼假擬氧化還原酶蛋白。

RT中出現(xiàn)Ds跳躍，株高得以回復(fù)(與WT相差不到 5 cm)，同時伴有新性狀穎殼雜斑的出現(xiàn)。因?yàn)镈s的跳躍，編碼假擬氧化還原酶基因得以回復(fù)原有結(jié)構(gòu)，但又有一點(diǎn)小差異，多了“CATCATGA”8個堿基。單從株高上分析，因?yàn)橛蠨s在該假擬氧化還原酶蛋白基因上切離，RT株高得以回復(fù)，接近野生型。結(jié)合MT因?yàn)橛蠨s在該基因的插入，表型矮化的特征，可以說明該編碼假擬氧化還原酶基因?qū)χ旮叩木S持具有重要作用?，F(xiàn)在難以確定的是RT中Ds跳躍后是插在了其他表達(dá)基因上，抑或插在非表達(dá)區(qū)，還是跳躍后被降解消失了，總之，Ds跳躍后的去向還有待研究。目前，使用 TAIL-PCR 的方法還沒有檢測到新的轉(zhuǎn)座位點(diǎn)，這就難以對該基因的功能作出更具體的判斷。因?yàn)榭赡苁荄s跳躍后插入新的表達(dá)基因，從而產(chǎn)生無法預(yù)知的變化，比如RT出現(xiàn)的穎殼帶有雜斑就是佐證。

植物矮化常與GA、BR的代謝有關(guān)，尤其是GA。GA是植物生長發(fā)育過程中一類重要的調(diào)節(jié)激素，對莖的伸長和植株增高具有重要的促進(jìn)作用。目前的研究顯示，在GA的合成中，有3種酶起到基本作用，GA2氧化酶、GA3氧化酶和GA20氧化酶，這3種酶都具有保守的2OG-Fe(Ⅱ)加氧酶蛋白結(jié)構(gòu)域，屬于2OG-Fe(Ⅱ)加氧酶蛋白超家族[11-14]，如黃瓜的GA2氧化酶、玉米的GA3氧化酶1、煙草的GA2氧化酶4、粳稻GA3-β羥化酶(即GA3氧化酶)等，都具有保守的2OG-Fe(Ⅱ)加氧酶蛋白結(jié)構(gòu)域。

本研究中的假擬氧化還原酶，同樣具有保守的2OG-Fe(Ⅱ)加氧酶蛋白結(jié)構(gòu)域，屬于2OG-Fe(Ⅱ)加氧酶超家族，且從上述研究不難推斷，該蛋白可能對水稻株高的維持具有重要作用。本研究中的假擬氧化還原酶蛋白是否影響到GA的正常合成還有待進(jìn)一步的研究和驗(yàn)證，揭示該基因真正的功能和作用機(jī)制。