張 聰，周常義，江 鋒，曾 磊，楊名平，蘇國成*

(1.集美大學 食品與生物工程學院，福建 廈門 361021；2.廈門中集信檢測技術有限公司，福建 廈門 361100)

擬除蟲菊酯類農藥(Pyrethroid pesticides)是仿效天然除蟲菊化學結構合成的廣譜性殺蟲劑，因具有高效、低毒、生物降解和觸殺作用強等特點，而得到了廣泛應用[1]。近年來，我國擬除蟲菊酯類農藥中毒事件時有發(fā)生，在農產品、食品中的殘留超標現(xiàn)象也比較突出[2-4]。該類農藥有蓄積性，對哺乳動物具有神經毒性、免疫毒性、生殖毒性和遺傳毒性，對一些非靶生物如昆蟲和水生生物也有毒害作用[5]，加之不合理的使用，其殘留會對人體健康造成影響，因此，加強動物源性食品中擬除蟲菊酯的檢測方法研究具有重要的現(xiàn)實意義。

目前，國內外對擬除蟲菊酯類農藥的檢測研究多集中于果蔬[6]、茶葉[7-8]和水體[9]等樣品，且主要采用氣相色譜法(GC)、氣相色譜-質譜法(GC-MS)和高效液相色譜法(HPLC)，可能產生假陽性，而且對食品中擬除蟲菊酯的分析很少采用液相色譜-串聯(lián)質譜法(LC-MS/MS)。Z-Sep+是十八烷基硅烷基團和二氧化鋯結合在同一個二氧化硅顆粒上[10]。作為兩性氧化物，二氧化鋯能強烈吸附含羧基、巰基的脂肪和蛋白質，將其制備成新型吸附劑用于魚肉[11]、植物油[12]、玉米和毛豆[13]樣品的前處理凈化，效果比較理想。本研究采用改進的QuEChERS方法對樣品前處理條件進行優(yōu)化，應用高靈敏度和高分離能力的超高效液相色譜-串聯(lián)質譜技術(UPLC-MS/MS)對擬除蟲菊酯類農藥進行檢測，實現(xiàn)了對動物性食品中10種擬除蟲菊酯類農藥殘留的簡單、快速測定。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

UItiMate3000 超高效液相色譜儀、TSQ Quantum Access Max 三重四極桿串聯(lián)質譜儀(美國Thermo公司)；Milli-Q 去離子超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)；3-30K 高速冷凍離心機(德國Sigma公司)；XW-80A 渦旋混合器(Kylin-Bell Lab Instruments)；OA-Sys 氮吹儀(美國Organomation 公司)；KQ-500型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

氟氰戊菊酯、高效氯氟氰菊酯、甲氰菊酯、高效氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氟胺氰菊酯、氯菊酯、聯(lián)苯菊酯和醚菊酯標準品(純度>95.9%，農業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所)；甲醇、乙腈(色譜純，德國Merck公司)；冰乙酸(優(yōu)級純，上海安譜科技公司)；乙酸銨(優(yōu)級純，天津市光復科技發(fā)展有限公司)；氯化鈉、無水乙酸鈉(分析純，西隴科學股份有限公司)；無水硫酸鎂(分析純，阿拉丁試劑有限公司)；PSA、C18吸附劑(博納艾杰爾科技有限公司)；Z-Sep+吸附劑(美國Supelco公司)。

1.2 標準溶液的配制

1.2.1擬除蟲菊酯單標儲備液的配制將10種標準品(100 mg/L)用甲醇配成10 mg/L的單標儲備液，置于棕色小瓶中，于-18 ℃冰箱中保存，有效期為6個月。

1.2.2擬除蟲菊酯混合標準工作液的配制分別移取上述10種擬除蟲菊酯單標儲備液0.1 mL，置于同一10 mL容量瓶中，用甲醇定容后制得100 μg/L的混合標準工作液，置于棕色小瓶中，于-18 ℃冰箱中保存，有效期為1個月。臨用時，配成不同濃度的標準工作溶液。

1.3 儀器條件

1.3.1色譜條件色譜柱：ACQUITY HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；柱溫：30 ℃；流速：0.25 mL/min；進樣量：5.0 μL；流動相：A為0.1%甲酸水溶液(含5 mmol/L乙酸銨)，B為甲醇；梯度洗脫程序：0～2.0 min，70% B；2.0～6.3 min，70%～95% B；6.3～6.5 min，95%～70% B；6.5～10.0 min，70% B。

1.3.2質譜條件離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應監(jiān)測(MRM)；噴霧電壓：3.8 kV；霧化溫度：210 ℃；離子傳輸溫度：250 ℃；鞘氣壓力：7.0×103Pa；輔助氣壓力：1.75×103Pa；碰撞氣壓力：0.2 Pa；10種擬除蟲菊酯的定性離子對、定量離子對、碰撞能量及錐孔電壓等參數(shù)見表1。

1.4 樣品前處理

1.4.1樣品制備參照GB/T5009.162-2008[14]和文獻[15]的方法，對采集的樣品用粉碎裝置進行處理，將處理好的樣品置于密閉干凈容器內并做好標記。試樣于-18 ℃以下冷凍保存，備用。

1.4.2樣品提取將所制得的樣品解凍后，準確稱取2.0 g(精確至0.01 g)置于50 mL具塞離心管中，加入1.0 g無水硫酸鎂、0.3 g無水乙酸鈉和0.6 g氯化鈉，再加入5.0 mL冰乙酸-乙腈(1∶ 99，體積比)提取液，渦旋均勻后，超聲提取10 min，8 800 r/min下離心3.5 min。將上清液全部移至另一15 mL具塞離心管中，重復提取1次，合并上清液，待凈化。

1.4.3樣品凈化將待凈化液置于-18 ℃下冷凍1 h。取3.0 mL冷凍后的上清液于含有500 mg無水硫酸鎂、150 mg Z-Sep+和150 mg C18的15 mL離心管中，渦旋，8 800 r/min下離心3.5 min，取2.0 mL上清液于另一15 mL離心管中，40 ℃下氮吹至近干，用甲醇-水(3∶ 1，體積比)定容至1.0 mL，渦旋溶解殘渣，過0.22 μm有機相尼龍濾膜，供UPLC-MS/MS分析。

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優(yōu)化

采用蠕動泵進樣的方式，將1 mg/L各擬除蟲菊酯單標溶液以20 μL/min的流速連續(xù)注入ESI源中，根據(jù)目標物的分子結構特征，在正離子檢測模式下進行一級質譜全掃描(Full scan)，得到待測物的準分子離子峰[M+NH4]+。優(yōu)化離子源氣流、電壓、溫度等參數(shù)使離子峰的響應強度最優(yōu)且響應達到穩(wěn)定狀態(tài)，對準分子離子峰進行二級質譜掃描，確定子離子和優(yōu)化的碰撞能量。優(yōu)化的質譜參數(shù)見表1。

表1 10種擬除蟲菊酯農藥的UPLC-MS/MS分析參數(shù)Table 1 Optimal parameters of ten pyrethroids analyzed by UPLC-MS/MS

2.2 液相色譜條件的優(yōu)化

2.2.1色譜柱的選擇根據(jù)擬除蟲菊酯類農藥的物理化學性質，本研究選用農殘分析常用的超高壓反相色譜柱ACQUITY HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)[16]和Hypersil GOLD C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，3.0 μm)[17]。通過比較兩種色譜柱對10種擬除蟲菊酯類農藥的分離效果、峰形和保留時間，發(fā)現(xiàn)在相同的程序洗脫條件下，前者的分離效果好，保留效果佳。因此最終選用ACQUITY HSS T3色譜柱。

圖1 10種擬除蟲菊酯混合標準溶液(100 μg/L)的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of 10 pyrethroids mixed standard solution(100 μg/L)1.flucythrinate；2.λ-cyhalothrin；3.fenpropathrin；4.β-cypermethrin；5.deltamethrin；6.fenvalerate；7.fluvalinate；8.permethrinⅠ；9.permethrinⅡ；10.bifenthrin；11.etofenprox

2.2.2流動相的選擇比較了甲醇-水、乙腈-水及在水相中添加不同的調節(jié)劑甲酸(0.05%、0.1%和0.2%)、乙酸銨(2、5、10 mmol/L)的分離效果。結果發(fā)現(xiàn)，在水相中加入甲酸時甲氰菊酯和醚菊酯的峰形較好，這是由于流動相中加入甲酸后有利于形成[M+H]+，從而提高其離子化效率。但大部分目標物的色譜峰仍拖尾嚴重；而向甲酸水流動相中加入乙酸銨后，10種擬除蟲菊酯均產生了[M+NH4]+母離子，且響應強度增大。將有機相甲醇換成乙腈，發(fā)現(xiàn)目標峰的分離程度較差且出峰時間較晚。因此，本研究采用0.1%甲酸水溶液(含5 mmol/L乙酸銨)-甲醇作為流動相。

2.2.3洗脫程序的選擇由于10種擬除蟲菊酯類農藥的結構和性質相近，采用等度洗脫目標化合物會在色譜柱中共流出。本實驗選取梯度洗脫程序，在參考文獻[18-20]的基礎上設置了5種梯度洗脫程序，綜合對比，最終選擇“1.3.1”的梯度洗脫程序。在優(yōu)化色譜條件下，10 min內可完成對10種擬除蟲菊酯農藥的分析。其總離子流圖見圖1。

2.3 提取溶劑的選擇

由于動物組織的基質相對復雜，極性較弱的目標化合物一般較難從含油脂樣品中提取出來，所以本實驗比較了乙腈、乙酸乙酯、丙酮及丙酮-正己烷(1∶ 1，體積比)作為提取溶劑時，對動物性食品中擬除蟲菊酯類農藥的提取效果。結果表明，乙腈對擬除蟲菊酯的回收率明顯高于其他3種溶劑。原因是乙腈對樣品中油脂和色素的提取量最小，在一定程度上降低了基質干擾，有利于凈化，同時其對擬除蟲菊酯類農藥的溶解度較高；乙酸乙酯的極性很弱，只提取了樣品中部分目標化合物，回收率較低；而用丙酮和正己烷提取時，提取液中干擾物質會增加，回收率較低。由于擬除蟲菊酯在堿性條件下不穩(wěn)定，所以進一步研究了乙腈與冰乙酸-乙腈(體積比1∶ 999、1∶ 99、2∶ 98)對擬除蟲菊酯類農藥回收率的影響。結果顯示，加入少量的冰乙酸時回收率增加，而冰乙酸-乙腈(2∶ 98)的回收率低于冰乙酸-乙腈(1∶ 99)，可能是由于擬除蟲菊酯類農藥在含1%冰乙酸的乙腈溶液中比較穩(wěn)定，而酸度過大時會抑制離子的傳輸效率。因此，選擇冰乙酸-乙腈(1∶ 99)作為提取溶劑。

2.4 吸附劑的選擇

提取液經低溫冷凍凈化后，仍有部分雜質，采用分散固相萃取方法對提取液再次凈化。而吸附劑種類的選取是分散固相萃取的關鍵，其中PSA材料的硅膠表面鍵合有極性官能團，具有極性吸附作用和弱陰離子交換功能，主要用于去除樣品中的有機酸、色素和金屬離子[21]；石墨化碳黑(GCB)具有片層結構，是一種非極性吸附劑，主要用于去除樣品中的色素、甾醇和維生素，但因其吸附性較強易導致部分農藥的回收率偏低[22]；C18的有效成分是硅膠鍵合的十八烷基，具有疏水性，主要用以去除脂肪和非極性物質[23]；Z-Sep+是二氧化硅顆粒上同時以單鍵結合二氧化鋯和C18的新型吸附劑，能有效吸附脂肪和色素等，被用于高含油植物中農藥的凈化處理[24]。

動物性食品含有較多的脂肪、蛋白質等干擾基質，在樣品凈化的過程中既需除去油脂等干擾物質，又需保留擬除蟲菊酯農藥，因此設計了4種凈化方式：① 150 mg PSA和150 mg C18；② 150 mg GCB和150 mg C18；③ 150 mg Z-Sep+和150 mg C18；④ 300 mg Z-Sep+，并在每組中均加入500 mg無水硫酸鎂。在25 μg/kg加標水平下，按照“1.4”方法對長毛明對蝦空白樣品進行前處理，以回收率為指標考察上述4種方式的凈化效果。結果發(fā)現(xiàn)，采用PSA和C18凈化時，氰戊菊酯和氟胺氰菊酯的回收率低于50%，相對標準偏差較大；采用GCB和C18凈化時，回收率均較低，可能是GCB的吸附性過強所致；采用Z-Sep+凈化時，回收率低于60%，可能是Z-Sep+對目標物產生了吸附；而采用Z-Sep+和C18凈化時，10種擬除蟲菊酯的回收率為70%～120%，符合檢測方法的要求。對Z-Sep+和C18吸附劑的用量進行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)用150 mg Z-Sep+和150 mg C18吸附劑能夠較好地凈化樣品。綜上所述，最終采用方法③對樣品進行凈化。

2.5 方法學驗證

2.5.1基質效應在液相色譜-串聯(lián)質譜定量分析的過程中，基質效應被認為是誤差的重要來源，常會導致檢測結果偏高或偏低[25]?；|效應(ME)可通過比較基質標準曲線和溶劑標準曲線的斜率進行評估： 通常情況下，當|ME|<20%時，為弱基質效應，可以忽略；當20%≤|ME|≤50%時，為中等程度基質效應；當|ME|>50%時，為強基質效應，須采取方法補償基質效應[26]。

按照“1.4”方法對空白樣品(長毛明對蝦、鋸緣青蟹、豬肉、鴨肉)進行前處理，然后配制空白基質匹配標準曲線和純溶劑標準曲線，測定基質效應。結果表明，氰戊菊酯在鋸緣青蟹中表現(xiàn)為較強的基質抑制效應，氯菊酯在長毛明對蝦和鋸緣青蟹中表現(xiàn)為基質增強效應，聯(lián)苯菊酯在鋸緣青蟹、豬肉和鴨肉中表現(xiàn)為弱的基質增強效應，而其他擬除蟲菊酯則表現(xiàn)為弱到中等的基質抑制效應。所以本實驗采用基質匹配標準溶液的方法，以降低基質效應的影響。

2.5.2線性范圍、檢出限與定量下限在優(yōu)化實驗條件下，用長毛明對蝦、鋸緣青蟹、豬肉和鴨肉4種空白樣品提取液將混合標準儲備液稀釋，配制成2.5～100 μg/L系列基質匹配標準溶液。以目標物的質量濃度為橫坐標，對應的定量離子峰面積為縱坐標繪制標準曲線。以3倍和10倍信噪比(S/N)分別計算目標物的檢出限(LOD)和定量下限(LOQ)。以長毛明對蝦空白基質為例，結果見表2。4種空白樣品中各目標物在線性范圍內呈良好的線性關系，相關系數(shù)(r2)均大于0.997，LOD為0.9～2.4 μg/kg，LOQ為3.0～8.0 μg/kg，低于最大殘留限量(MRLs)[28]。

表2 長毛明對蝦空白基質中擬除蟲菊酯的線性方程、相關系數(shù)、線性范圍、檢出限及定量下限 Table 2 Linear equations，correlation coefficients(r2)，linear ranges，LODs and LOQs of pyrethroids in blank Penaeus penicillatus

2.5.3回收率與精密度在優(yōu)化實驗條件下，選用長毛明對蝦、鋸緣青蟹、豬肉和鴨肉4種空白樣品，對10種擬除蟲菊酯進行10、50、100 μg/kg 3個水平的加標回收實驗，每個加標水平重復3次，回收率和相對標準偏差(RSD)見表3。3個加標水平的平均回收率為70.3%～120%，RSD為1.2%～11.2%。結果滿足歐盟SANTE/11813/2017對食品中農藥殘留分析的規(guī)定[27]。表明該方法的準確度和精密度達到分析要求。

表3 10種擬除蟲菊酯在樣品中的回收率及相對標準偏差(n=6)Table 3 Spiked recoveries and relative standard deviations(RSD)of ten pyrethroids in samples(n=6)

(續(xù)表3)

PesticideSpiked(μg/kg)Penaeus penicillatusScylla serrataPorkDuckRecovery(%)RSD(%)Recovery(%)RSD(%)Recovery(%)RSD(%)Recovery(%)RSD(%)5098.5 2.7 86.0 5.2 106 2.7 1064.6 10088.9 6.5 96.8 3.9 89.8 4.5 99.2 7.2 Bifenthrin1073.8 9.3 96.1 7.5 113 1.9 81.3 4.3 501058.6 1123.0 103 3.5 106 5.9 10082.9 11.2 108 5.6 92.6 5.3 111 9.4 Etofenprox1089.59.397.48.11098.097.96.5501008.61015.71037.388.74.710099.26.199.05.099.73.899.78.3

2.5.4實際樣品的檢測為驗證本方法在動物性食品中的有效性，從廈門超市和農貿市場隨機購買40份樣品，包括長毛明對蝦、鋸緣青蟹、豬肉和鴨肉，采用本方法對10種擬除蟲菊酯進行分析測定。其中2份長毛明對蝦檢出高效氯氰菊酯，含量分別為3.7、5.2 μg/kg；1份鋸緣青蟹檢出高效氯氰菊酯，含量為6.1 μg/kg；1份鋸緣青蟹中檢出溴氰菊酯，含量為7.3 μg/kg；1份長毛明對蝦檢出氟胺氰菊酯，含量為8.6 μg/kg；2份豬肉檢出高效氯氟氰菊酯，含量分別為6.7、8.0 μg/kg；1份鴨肉檢出溴氰菊酯，含量為5.5 μg/kg；1份鴨肉檢出氟胺氰菊酯，含量為5.8 μg/kg。結果均未超出最大殘留限量10 μg/kg的要求[28]。結果表明，該方法可用于動物性食品中10種擬除蟲菊酯的檢測。

3 結 論

本文通過優(yōu)化提取溶劑和吸附劑，以及色譜和質譜條件，建立了動物性食品中10種擬除蟲菊酯的改進QuEChERS/UPLC-MS/MS檢測方法。研究結果表明，本方法的前處理簡單、靈敏度高、準確性好，可滿足動物性食品中10種擬除蟲菊酯類農藥殘留的快速分析要求。