王威利，李亞菲，張 展，何綺霞，黃曉梅，蘇秋權(quán)，丁晨紅，林雪賢，殷秋妙，吳維煇*

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品公共監(jiān)測中心，廣東 廣州 510640；2.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室(廣州)，廣東 廣州 510640；3.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測與評價重點實驗室，廣東 廣州 510640)

溴吡斯的明(Pyridostigmine bromide，PB)是新斯的明的衍生物，為擬膽堿藥中的抗膽堿酯酶藥。進(jìn)入機體后，通過可逆性抑制膽堿酯酶活性[1-2]，使乙酰膽堿不能水解，從而提高體內(nèi)受體部位的乙酰膽堿濃度，呈現(xiàn)出全部膽堿能神經(jīng)興奮的效應(yīng)，如引起胃腸、子宮和膀胱平滑肌收縮等[3]。在養(yǎng)殖業(yè)，PB常用于治療牛羊前胃疾病、動物便秘以及分娩期和產(chǎn)后疾病等[2]，對長期血流不暢造成的神經(jīng)肌肉衰弱也有良好療效。PB的長期大劑量使用，可能會引起畜禽動物體內(nèi)乙酰膽堿蓄積而發(fā)生集體中毒，表現(xiàn)腹瀉、嘔吐、胃痙攣等癥狀[4]，造成嚴(yán)重?fù)p失。PB僅被允許直接給藥用作治療，根據(jù)《飼料藥物添加劑使用規(guī)范》[5]，禁止在飼料中使用。但隨著養(yǎng)殖業(yè)集約化、規(guī)?；l(fā)展，PB作為治療藥物，有違法在飼料中濫用和添加用作治療和預(yù)防的安全風(fēng)險。由于目前缺少相應(yīng)的檢測方法及標(biāo)準(zhǔn)，無法對市場上PB的使用情況進(jìn)行排查及監(jiān)測。因此，建立飼料中PB含量的測定方法，可規(guī)范飼料中添加劑藥物使用，為監(jiān)控飼料中PB的使用情況以及飼料質(zhì)量安全風(fēng)險評估的深入研究提供技術(shù)支持。

目前，國內(nèi)外關(guān)于PB藥物殘留的檢測方法研究較少，且大多為動物血漿中PB的測定和藥代動力學(xué)研究，主要采用放射免疫法、氣相色譜法、離子對色譜法、高效液相色譜法等[6-25]。但由于飼料成分復(fù)雜、基質(zhì)干擾較大，針對飼料中PB的檢測方法國內(nèi)外尚未見報道。本文基于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的高選擇性、高靈敏度和定性準(zhǔn)確等特點，建立了飼料中PB的快速定性定量方法，能滿足飼料質(zhì)量安全檢測和國家藥物監(jiān)控的要求。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

LC-MS/MS8040三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(島津公司)，配電噴霧離子源(ESI)；Milli-Q超純水器(Merk Millipore公司)；電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)；H2050高速冷凍離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)；氮吹儀(美國Organomation Associates Inc.)；旋渦儀(Labnet公司)。甲醇、乙腈、甲酸、甲酸銨(色譜純，Merck公司)；正己烷(分析純，廣州試劑廠)；PB標(biāo)準(zhǔn)品(含量：99.4%，中國食品藥品檢定研究院)；內(nèi)標(biāo)PB-D6(含量：98.0%，TLC PharmaChem Inc.)；混合性弱陽離子交換柱(WCX，150 mg/6 mL，日本島津公司)；實驗用水為超純水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確稱量PB和內(nèi)標(biāo)PB-D6標(biāo)準(zhǔn)品適量，分別置于10 mL容量瓶中，用乙腈定容，配成1 g/L標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，避光-18 ℃貯存。標(biāo)準(zhǔn)儲備液用乙腈稀釋定容，制成10 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)中間液，-18 ℃貯存。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：精密吸取一定量的PB標(biāo)準(zhǔn)儲備液和PB-D6標(biāo)準(zhǔn)中間液至10 mL容量瓶中，用10%乙腈水溶液逐步稀釋成1、2、5、10、20、50、100 μg/L的溶劑標(biāo)準(zhǔn)工作液(內(nèi)標(biāo)PB-D6均為5 μg/L)，分別用不同類型飼料空白陰性樣品的提取液配制相應(yīng)的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，供測定。

內(nèi)標(biāo)PB-D6工作液：準(zhǔn)確量取一定量內(nèi)標(biāo)PB-D6標(biāo)準(zhǔn)中間液置于10 mL容量瓶中，用乙腈定容，配成100 μg/L 的內(nèi)標(biāo)工作溶液，4 ℃貯存。

1.3 樣品前處理方法

1.3.1配合飼料、濃縮飼料、精料補充料稱取(2±0.05) g飼料于50 mL具塞離心管中，準(zhǔn)確加入100 μL內(nèi)標(biāo)PB-D6工作溶液，加入20 mL甲醇，渦旋混勻30 s，超聲提取10 min，以10 000 r/min離心5 min，取10 mL上清液置于50 mL離心管中，于50 ℃水浴中氮吹至近干后，加10 mL超純水溶解，待凈化。

1.3.2添加劑預(yù)混合飼料稱取(2±0.05) g飼料于50 mL具塞離心管中，準(zhǔn)確加入100 μL內(nèi)標(biāo)PB-D6工作溶液，加入20 mL乙腈，渦旋混勻30 s，超聲提取10 min，以10 000 r/min離心5 min，取10 mL上清液置于50 mL離心管中，于50 ℃水浴中氮氣吹至近干后，加10 mL超純水溶解，待凈化。

1.3.3凈化在上述溶液中加入10 mL正己烷凈化脫脂，渦旋30 s，10 000 r/min離心 5 min，棄去上層正己烷。取混合型弱陽離子交換柱WCX，依次用6 mL甲醇和6 mL水活化，取5 mL樣品提取液過柱，棄去流出液，再依次用水、甲醇各6 mL淋洗，減壓抽干，棄去淋洗液，用10 mL 1%甲酸甲醇溶液洗脫，洗脫液于水浴中50 ℃氮氣吹干，用10%乙腈水溶液0.5 mL超聲溶解，渦旋30 s，過0.22 μm濾膜，供測定。

1.4 色譜-質(zhì)譜條件

色譜條件：HR-ODS-C18色譜柱(150 mm×3.0 mm×3 μm，島津公司)；柱溫：40 ℃；流動相：A為5 mmol/L甲酸銨-0.1%甲酸水溶液，B為乙腈；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL；線性梯度洗脫程序：0～1.2 min，3%～15% B；1.2～5.8 min，15% B；5.8～6.5 min，15%～ 50% B；6.5～8.0 min，50%B；8.0～8.5 min，50%～ 3% B；8.5～12 min，3%B。

質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源(ESI)，正離子掃描，電離電壓4.5 kV，加熱模塊400 ℃，多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)方式檢測，其他質(zhì)譜條件見表1。

表1 溴吡斯的明的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters of pyridostigmine bromide

*quantitative ion,dwell time：0.1 s

2 結(jié)果與討論

2.1 流動相的選擇

乙腈和甲醇為液相色譜常用的有機相，二者對藥物溶解性有差異，實驗對比了二者作為有機相時對PB色譜峰形的影響。結(jié)果表明，乙腈作為有機相時PB的峰形和保留時間均優(yōu)于甲醇，因此選擇乙腈為有機相。

實驗嘗試在0.1%甲酸水流動相中加入甲酸銨，發(fā)現(xiàn)加入甲酸銨后PB的峰形顯著改善，且響應(yīng)值提高。隨后比較了在0.1%甲酸水中加入終濃度為5、10 mmol/L甲酸銨的效果，結(jié)果顯示，甲酸銨濃度對PB響應(yīng)值及峰形影響不明顯，因此選擇5 mmol/L甲酸銨-0.1%甲酸水為水相。

2.2 樣品提取溶劑的確定

由于PB為強極性物質(zhì)，且飼料種類多、組分差別較大，實驗分別選用乙腈、1%甲酸乙腈溶液、甲醇、氯仿、乙醇、水為提取溶劑，考察了其對配合飼料、濃縮飼料、添加劑預(yù)混合飼料和精料補充料代表性飼料的提取效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以水為提取劑時，配合飼料及濃縮飼料的回收率較高，但由于飼料中其他組分和較高含量的無機鹽易溶于水，不利于后續(xù)凈化處理，且不揮發(fā)性無機鹽對儀器分析有損害。因此，選擇配合飼料、濃縮飼料、精料補充料的提取劑為甲醇，添加劑預(yù)混合飼料的提取劑為乙腈。

2.3 樣品的凈化

采用甲醇和乙腈提取時無機鹽溶解雖然較少，但提取出的非極性脂類較多，影響實驗結(jié)果的穩(wěn)定性，因此需對樣品提取液進(jìn)一步凈化。

圖1 配合飼料中PB的特征離子質(zhì)量色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of pyridostigmine bromide in compound feed sampleA：standard solution；B：blank sample；C：PB in compound feed sample

實驗在樣品提取溶液中加入正己烷進(jìn)行除脂，結(jié)果表明正己烷的脫脂效果良好，PB的回收率達(dá)96%以上，基質(zhì)干擾也有所降低。但正己烷不能除去提取液中的無機鹽，因此實驗考察了PSA、HLB小柱、MCX小柱、WCX(150 mg/6 mL)和WCX(60 mg/3 mL)凈化柱作為固相分散凈化吸附劑的效果。結(jié)果表明，PSA對PB有少量吸附，PB的回收率為80%左右。HLB對PB的保留效果較差，一部分目標(biāo)物隨提取液流失，回收率為60%左右。由于PB是一種鹽，其在水溶液(pH值近中性)中離解出正離子基團(tuán)和溴負(fù)離子，而MCX小柱為混合性強陽離子交換柱，帶有很強的磺酸基團(tuán)，對PB具有很強的保留效果，很難將其洗脫。而混合性弱陽離子交換柱WCX(150 mg/6 mL)，帶有羧酸基，對PB正離子基團(tuán)的保留效果很好，并且易于洗脫。通過對比WCX(150 mg/6 mL)和WCX(60 mg/3 mL)兩種規(guī)格小柱發(fā)現(xiàn)，PB在WCX(150 mg/6 mL)上的回收率接近100%，在WCX(60 mg/3 mL)上的回收率僅90%左右，且在水溶液上樣WCX(150 mg/6 mL)固相柱的流出液中未檢出PB。因此，最終選用WCX(150 mg/6 mL)小柱作為凈化用固相萃取小柱。

2.4 洗脫體積的選擇

考察了1%甲酸甲醇作為洗脫劑時不同洗脫體積(1、2、5、10、15、20 mL)對WCX上PB的洗脫情況。當(dāng)洗脫體積為10 mL時，能完全將凈化柱上的PB洗脫下來，最終選擇洗脫體積為10 mL。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液的穩(wěn)定性試驗

分別量取適量的PB和PB-D6標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用乙腈溶解稀釋配成1 g/L標(biāo)準(zhǔn)貯備液，于-20 ℃下儲存。分別用乙腈稀釋成0.1 mg/L標(biāo)準(zhǔn)工作液，于4 ℃下儲存。分別于儲存時及儲存后1、2、3、4周用流動相將標(biāo)準(zhǔn)工作液稀釋成10 g/L PB標(biāo)準(zhǔn)溶液(內(nèi)標(biāo)5 g/L)供儀器分析，與重新配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行對比，觀察其峰面積的重復(fù)性。結(jié)果表明，標(biāo)樣在該條件下穩(wěn)定，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于2%，因此標(biāo)準(zhǔn)溶液貯備液于4 ℃冰箱中保存有效期為1個月。同時對標(biāo)準(zhǔn)貯備液進(jìn)行6個月的反復(fù)凍融穩(wěn)定性試驗，結(jié)果表明，在-20 ℃保存的標(biāo)準(zhǔn)貯備液穩(wěn)定，無明顯降解和變化。

2.6 線性范圍、檢出限與定量下限

采用配合飼料、濃縮飼料、預(yù)混合飼料、精料補充料對應(yīng)的空白陰性樣品溶液，將PB和PB-D6標(biāo)準(zhǔn)工作液，逐步稀釋成PB質(zhì)量濃度分別為1、2、5、10、20、50、100 μg/L的溶劑標(biāo)準(zhǔn)工作液(內(nèi)標(biāo)PB-D6均為5 μg/L)。在優(yōu)化實驗條件下，以PB的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x,μg/L)，PB與內(nèi)標(biāo)的峰面積之比為縱坐標(biāo)(y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如表2所示。各種飼料基質(zhì)中,PB在1～100 μg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，線性系數(shù)(r2)均大于0.999。在空白飼料中添加PB標(biāo)準(zhǔn)品，按照本方法進(jìn)行樣品前處理后，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定，以信噪比S/N≥3計算方法的檢出限(LOD)；以S/N≥10計算方法的定量下限(LOQ)。結(jié)果顯示，在不同飼料基質(zhì)中PB的檢出限均為1.0 μg/kg，定量下限均為2.0 μg/kg(見表2)。PB標(biāo)準(zhǔn)溶液、配合飼料空白及空白添加PB 2 μg/kg(內(nèi)標(biāo)PB-D6為10 μg/kg)的MRM色譜圖見圖1。

表2 PB在不同飼料基質(zhì)中的回歸方程、相關(guān)系數(shù)(r2)、檢出限及定量下限Table 2 Linear equations，correlation coefficients(r2)，limits of detection(LODs)and limits of quantitation(LOQs)of pyridostigmine bromide in different feeds

2.7 回收率與精密度

選取配合飼料、濃縮飼料、添加劑預(yù)混合飼料和精料補充料空白飼料樣品，添加PB標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)，其中配合飼料加標(biāo)水平為2.0、5.0、10.0 μg/kg，濃縮飼料為2.0、5.0、50.0 μg/kg，添加劑預(yù)混合飼料為2.0、10.0、100 μg/kg，PB-D6為5.0 μg/kg，每個加標(biāo)水平做5次平行。結(jié)果顯示，PB在上述飼料中的平均加標(biāo)回收率為96.1%～108%，RSD為2.8%～8.3%，符合方法學(xué)要求。

3 結(jié) 論

本文建立了配合飼料、濃縮飼料、預(yù)混合飼料以及精料補充料中PB的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法，采用串聯(lián)質(zhì)譜和同位素內(nèi)標(biāo)消除了飼料復(fù)雜基質(zhì)的影響，提高了定量準(zhǔn)確性。該方法簡便，靈敏度高，且方法的回收率、精密度和定量下限均符合獸藥殘留分析要求，可以滿足實際檢測工作的需要。