蔣智勇，蔡汝健，楚品品，林德銳 ，勾紅潮，李 艷，宋 帥，李春玲

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所/ 廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省獸醫(yī)公共衛(wèi)生公共實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，廣東 廣州 510640；2. 廣東永順生物制藥股份有限公司，廣東 廣州 511356）

豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus，PCV）屬于圓環(huán)病毒科（Circoviridae）圓環(huán)病毒屬（Circovirus），為無(wú)囊膜的單股環(huán)狀DNA（ssDNA）病毒，基因組約2 kb，是最小的自主復(fù)制病毒基因組?，F(xiàn)已知PCV有PCV1和PCV2 2個(gè)血清型［1］，其中PCV1不具有致病性，而PCV2能引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征、豬皮炎腎病綜合征、豬增生性壞死性肺炎及其他豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾?。?-3］。

2016年美國(guó)學(xué)者從豬群中檢測(cè)到一種能引起母豬皮炎腎病綜合征與繁殖障礙的PCV3，該病毒從出現(xiàn)病癥的母豬或仔豬中分離得到，同時(shí)PCV2檢測(cè)為陰性［4-5］?；蚪M序列分析發(fā)現(xiàn)，PCV3基因組包含2 000 bp，具有與PCV1和PCV2相似的基因組結(jié)構(gòu)，主要編碼Cap和Rep兩個(gè)基因［5］。隨后在我國(guó)遼寧、福建、河北、江西、重慶、廣東、廣西和山東等地也有發(fā)現(xiàn)PCV3 感染［6-8］。

為更好地了解和監(jiān)控PCV3在華南地區(qū)的流行、遺傳進(jìn)化以及毒株的變異情況，本研究應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)華南地區(qū)豬場(chǎng)送檢的臨床樣品進(jìn)行PCV3檢測(cè)，并對(duì)陽(yáng)性樣品進(jìn)行全基因組擴(kuò)增和測(cè)序，以了解PCV3的分子流行病學(xué)狀況，為PCV3的免疫預(yù)防和分子致病機(jī)制研究等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

病料采自2017年華南地區(qū)（廣東、海南、廣西和湖南）26個(gè)豬場(chǎng)，共采集樣品246份，包括淋巴結(jié)、脾臟、肺臟、血清、精液以及流產(chǎn)胎兒等。

主 要 試 劑：PremixExTaqTM和DL 2000 Marker為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品（TaKaRa），病毒DNA/RNA提取試劑盒為Magen公司產(chǎn)品，Taq PreMix聚合酶為Promega公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 參照Palinski等［5］合成1對(duì)引物用于PCV3的熒光定量PCR檢測(cè)，并設(shè)計(jì)2對(duì)引物用于PCV3全基因組擴(kuò)增（表1）。引物所在位置參照PCV3株（GenBank收錄號(hào)：KY075988.1），引物和探針由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 PCV3引物和探針序列

1.2.2 PCV3熒光定量PCR檢測(cè) 病毒DNA的提取按照病毒DNA/RNA 提取試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，提取的DNA用于熒光定量PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增方法參照Palinski等［5］進(jìn)行臨床樣品的PCV3檢測(cè)并統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

1.2.3 PCV3全基因組序列測(cè)定與分析 PCV3全基因組擴(kuò)增反應(yīng)體系（50μL） ：去離子水21μL，上、下游引物各1μL（工作濃度0.2μmol/L），2×PremixEx Taq25μL， 提取的DNA模板2μL。擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性20 s、60℃退火30 s、72℃延伸 90 s，共 35個(gè)循環(huán)；72℃后延伸5 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，對(duì)符合預(yù)期大小的PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

1.2.4 全基因序列的拼接及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析將測(cè)序獲得的2 段序列進(jìn)行拼接后得到PCV3的全基因序列，應(yīng)用生物學(xué)分析軟件DNAStar、ClustalX 2.1和Mega 6.0對(duì)PCV3全基因組及ORF2基因序列以及推導(dǎo)的氨基酸序列與國(guó)內(nèi)外PCV3參考毒株序列進(jìn)行比對(duì)并繪制遺傳進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCV3臨床樣品的檢測(cè)

應(yīng)用熒光定量PCR方法對(duì)26個(gè)豬場(chǎng)臨床送檢的組織、精液和血清共246份樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果26個(gè)豬場(chǎng)中有19個(gè)豬場(chǎng)為PCV3陽(yáng)性場(chǎng)，豬場(chǎng)陽(yáng)性率為69.2%（18/26），PCV3樣品總檢出陽(yáng)性率為46.3%（114/246）。

2.2 PCV3的PCR檢測(cè)及全基因組擴(kuò)增

經(jīng)熒光定量PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的病料和血清進(jìn)行全基因組擴(kuò)增，引物PCV3-F1/PCV3-R1經(jīng)PCR擴(kuò)增后獲得大小為1.1 kp的片段，引物PCV3-F2/PCV3-R2擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物片段約1.2 kb（圖1），與預(yù)期大小相符。將PCR產(chǎn)物送到上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序并拼接，用于遺傳信息分析。

圖2 基于PCV3全基因序列的遺傳進(jìn)化樹(shù)

2.3 PCV3全基因組的遺傳進(jìn)化分析

圖1 PCV3全基因組PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

將擴(kuò)增測(cè)序的毒株序列拼接后提交GenBank，獲得7株P(guān)CV3，分別命名為GDFS、GD-GZ、GD-JM、GD-MZ、GD-YF、GX 2017和Hainan株，GenBank收錄號(hào)分別為MG253678～MG253684。對(duì)分離的 7株 PCV3毒株與來(lái)自美國(guó)（US-MO2015、US-MN2016）、意大利（PCV3-IT CO2017）［9］、韓國(guó)（KU-1601，KU-1607）［10］和國(guó)內(nèi)的 9株 PCV3毒株序列應(yīng)用DNAstar的MegAline軟件進(jìn)行核苷酸同源性比較分析并構(gòu)建了遺傳進(jìn)化樹(shù)（圖2）。結(jié)果表明，分離測(cè)序的7株P(guān)CV3毒株之間的核苷酸序列同源性為98.9%～99.8%，PCV3分離株與PCV3國(guó)內(nèi)外參考毒株的核苷酸同源性在97.4%～99.8%之間。PCV3可分為PCV3a、PCV3b和PCV3c 3個(gè)亞群，在華南地區(qū)分離的7株P(guān)CV3分別有2株、2株和3株分別位于PCV3a、PCV3b和PCV3c亞群，表明PCV3在華南地區(qū)呈現(xiàn)出遺傳多樣性。

2.4 PCV3 ORF2基因的遺傳進(jìn)化分析

PCV3 ORF2基因長(zhǎng)645 bp，編碼214 aa，PCV3 ORF2基因比PCV2的ORF2基因短。本研究分離測(cè)序的7株P(guān)CV3毒株之間的核酸序列同源性為98.1%～99.5%，而與PCV3國(guó)內(nèi)外參考毒株的核苷酸同源性在96.6%～99.8%之間。

分離的7株P(guān)CV3 ORF2基因推導(dǎo)的氨基酸序列與參考毒株同源性在96.7%～99.5%之間。ORF2基因編碼的Cap蛋白序列出現(xiàn)了4處比較一致的突變，分別為V24A、K27R、T77S和L150I。基于 PCV3 ORF2基因構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹(shù)（圖3）與PCV3全基因組構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹(shù)（圖2）存在部分差異，結(jié)果同樣表明這些毒株可以大致分為3個(gè)分支（PCV3a、PCV3b和PCV3c）。GD-GZ與參考毒株Jiangxi-62-2016、KU-1607-2016和 PCV3-IT CO2017具有V24A和K27R突變屬于PCV3c，GD-MZ與參考毒株Anhui-14-2016、PCV3 Fujian和Henan-13-2016株具有T77S和L150I突變屬于PCV3b，GD-YF和Hainan株同時(shí)具有PCV3c的V24A和PCV3b的T77S突變暫歸為PCV3c，GD-JM具有1處L150I突變，不具有這4處突變的GX 2017和GD-FS株與其余的參考毒株屬于PCV3a（圖4）。

圖3 基于PCV3 ORF2基因序列的遺傳進(jìn)化樹(shù)

3 結(jié)論與討論

自2016年以來(lái)，我國(guó)部分?。ㄊ校┫嗬^出現(xiàn)以母豬流產(chǎn)和死亡、斷奶仔豬呼吸衰竭和死亡為臨床特征的PCV3感染報(bào)道［8,11］，也有研究表明PCV3可引起仔豬腹瀉［12］。目前尚不清楚PCV3的起源，追溯性研究表明PCV3于2015年即存在于我國(guó)豬場(chǎng)，此后呈現(xiàn)上升趨勢(shì)［13］。

目前國(guó)內(nèi)外先后建立了PCR、熒光定量PCR、ELISA以及鑒別診斷PCV2與PCV3的雙重?zé)晒舛縋CR方法［14-18］。本研究應(yīng)用熒光定量PCR方法對(duì)臨床樣品進(jìn)行PCV3檢測(cè)，結(jié)果PCV3總檢出率為46.3%（114/246），豬場(chǎng)陽(yáng)性率為69.2%（18/26）。PCV3可以在不同的豬組織如腦、肺、脾臟、淋巴結(jié)、扁桃體、心臟、腎以及精液和血清中均可檢出，其中以肺和淋巴結(jié)檢出率最高，研究結(jié)果表明PCV3在華南地區(qū)已廣泛存在。

將PCV3熒光PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的樣品進(jìn)行全基因組擴(kuò)增與測(cè)序分析，共獲得7株P(guān)CV3全基因組序列，PCV3全基因組長(zhǎng)為2 000 bp，ORF2基因長(zhǎng)為645 bp。本研究分離的7株P(guān)CV3與國(guó)內(nèi)外的參考毒株的全基因組核苷酸同源性在97.4 %～99.8%之間，ORF2基因的同源性在96.6%～99.8%之間?；贠RF2基因構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹(shù)可以將PCV3分為PCV3a、PCV3b和 PCV3c亞 型， 與 Fu等［13］以 PCV3 Cap蛋白的V24A、K27R突變將PCV3分為3個(gè)亞型結(jié)果一致。 本研究進(jìn)一步結(jié)合另外2個(gè)突變T77S和L150I作為分型依據(jù)。中國(guó)分離株與美國(guó)、歐洲和韓國(guó)分離株具有很高的同源性，也說(shuō)明PCV3毒株的基因組比較穩(wěn)定。本研究對(duì)PCV3的分子流行病學(xué)研究為開(kāi)展PCV3的監(jiān)測(cè)與防控提供了技術(shù)支持，PCV3的致病性與PCV2的關(guān)系等有待進(jìn)一步研究。

圖4 PCV3分離株Cap蛋白推導(dǎo)的氨基酸序列比對(duì)分析