傅柳陶，王青元，衛(wèi) 兵，王文艷

在我國，宮頸癌是致死率較高的婦科惡性腫瘤之一[1]。由于宮頸癌起病隱匿，早期缺乏典型的臨床癥狀，加之惡性化程度高，進(jìn)展迅速，大部分患者確診時已至中晚期，從而錯過了手術(shù)的最佳時機，因此中晚期患者的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率一直居高不下[2-3]。因此實現(xiàn)對于宮頸癌患者的早診斷、早治療是降低患者死亡率的關(guān)鍵。腫瘤細(xì)胞因線粒體功能缺陷導(dǎo)致糖代謝異常被公認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞的重要特征之一[4]。但是有氧糖酵解途徑的發(fā)生機制和調(diào)控方式一直未有明確研究。磷酸甘油酸變位酶1(phosphoglycerate mutase1，PGAM1)作為糖酵解途徑中的關(guān)鍵酶，可催化3-磷酸甘油生成2-磷酸甘油，并且有研究[5]證實，PGAM1是唯一受抑癌基因P53調(diào)控的糖酵解相關(guān)酶。該研究首先通過免疫組化法探討PGAM1在宮頸癌組織中的表達(dá)情況，并通過機制研究進(jìn)一步分析PGAM1在腫瘤細(xì)胞糖酵解及發(fā)生發(fā)展中的作用，從而為臨床治療和藥物研發(fā)提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1病例資料收集2016年7月～2017年10月在安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院行手術(shù)切除的67例宮頸癌患者的新鮮宮頸癌組織(排除腫瘤壞死區(qū))及配對的癌旁正常組織(距離腫瘤邊緣>3 cm)，將一部分組織標(biāo)本立即置于液氮中，然后轉(zhuǎn)移至-80 ℃ 保存以備RNA和蛋白提取用；另一部分組織標(biāo)本經(jīng)石蠟包埋，以進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色用?；颊吣挲g30～65(47.50±2.46)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：由兩名以上經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)師對組織切片進(jìn)行閱片并同時確診；所有患者術(shù)前未接受過放療、化療或其他輔助治療。

1.2受試細(xì)胞人宮頸癌細(xì)胞株Hela以及HEK293T細(xì)胞均購自美國Type Culture Collection公司。

1.3主要試劑胎牛血清(FBS)、RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶-EDTA細(xì)胞消化液(0.25%)(美國GIBCO公司)；MTT(美國Sigma公司)；青霉素和鏈霉素(山東醫(yī)藥股份有限公司)；二甲基亞砜(DMSO)(江西省江藍(lán)純生物試劑有限公司)；S-P免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；PGAM1抗體、辣根酶標(biāo)記的二抗(美國Abcam公司)；TRIzol總RNA提取試劑盒、細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑 LipofectamineTM2000、Opti-MEM(美國Invitrogen公司)；Taqman? RNA reverse transcription kit、Taqman? RNA assay kit(日本Takara公司)；cDNA合成試劑盒(美國OMEGA公司)；SYBR Green PCR Mix、M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶(美國ABI公司)。PCR引物以及siRNA干擾靶序列由上海生工生物工程有限公司合成并提供。

1.4主要儀器HERcell1501型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱和超凈工作臺(美國Thermo Scientific公司)；Eppendorf 5427 R臺式高速冷凍離心機以及各種型號的移液器(德國 Eppendorf公司)；實時定量PCR儀、iMake多功能酶標(biāo)儀、SDS-PAGE電泳儀和電轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司)；CX41倒置光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；Amersham電泳儀(瑞典Bioscience公司)；LAS-4000min凝膠成像數(shù)碼分析系統(tǒng)(日本FujiFilm公司)。

1.5方法

1.5.1免疫組化 取石蠟包埋組織進(jìn)行切片(1～2 μm)后行免疫組織化學(xué)染色，嚴(yán)格按照SP試劑盒說明書進(jìn)行操作。隨機選擇10個視野，觀察PGAM1在不同組織中的染色強度以及陽性細(xì)胞的百分比。PGAM1呈細(xì)胞質(zhì)棕黃色染色。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)為觀察細(xì)胞染色強度：0分(陰性)，1分(弱染色)，2分(中度染色)，3分(強染色)，然后計算10個視野的平均染色分值。同時觀察視野中染色細(xì)胞的百分比：0分(陽性率為0)，1分(陽性率≤25%)，2分(陽性率25%～50%)，3分(陽性率50%～75%)，4分(陽性率>75%)。染色指數(shù)(labeling index，LI)=陽性細(xì)胞率×染色強度，LI≤6分為低表達(dá)或不表達(dá)，LI>6分為高表達(dá)。

1.5.2細(xì)胞培養(yǎng) 將細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%FBS的完全RPMI 1640培養(yǎng)基中，將細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。24～48 h更換培養(yǎng)液，48 h傳代1次。

1.5.3構(gòu)建PGAM1基因沉默穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株 ① 構(gòu)建慢病毒干擾載體：從GenBank 中獲得編碼人PGAM1基因(NM-003483)的序列；選擇pGMLV-GFP RNAi慢病毒載體，構(gòu)建慢病毒重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染至感受態(tài)細(xì)胞DH5α中。采用質(zhì)粒抽提試劑盒提取慢病毒重組質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，測定慢病毒滴度。② PGAM1基因沉默穩(wěn)定細(xì)胞系的建立：提前1 d在相應(yīng)備行轉(zhuǎn)染的6孔板上接種5×105個細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，待融合率達(dá)到 50%～60%時，按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染說明書，將PGAM1 shRNA或shRNA-NC治療轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h。提取細(xì)胞RNA及蛋白，驗證目的基因表達(dá)情況及轉(zhuǎn)染效率。

1.5.4MTT法檢測細(xì)胞增殖 將各組細(xì)胞(1×104個/孔)單層接種至96孔板中正常培養(yǎng)，每組設(shè)置8個平行孔，分別培養(yǎng)24、48、72、96 h后，加入20 μl MTT，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 h后，棄除上清液，每孔加入200 μl DMSO，使紫色結(jié)晶物充分溶解。將96孔板放置于酶標(biāo)儀卡槽上，檢測波長為570 nm，參比波長為450 nm處的吸光度值(OD值)，計算平均值。

1.5.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 收集細(xì)胞，采用預(yù)冷的PBS洗滌3次后，離心，棄上清液；加入500 μl Binding Buffer重懸，細(xì)胞數(shù)量約為1×104個/100 μl；加入Annexin V 5 μl，避光孵育15 min；離心，棄上清液；加入500 μl Binding Buffer重懸；加入PE 5 μl，避光孵育15 min；離心，棄上清液；加入300 μl結(jié)合緩沖液；上機檢測。所有操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作進(jìn)行。采用流式細(xì)胞儀(Ex=488 nm，Em=530 nm)檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.5.6熒光定量實時PCR(quantitative realtime PCR，qRT-PCR) ① 總RNA提?。翰捎梅止夤舛扔嫏z測RNA濃度。② RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA：根據(jù)試劑盒說明書操作進(jìn)行。將cDNA保存至-20 ℃保存?zhèn)溆?。?qRT-PCR：根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫資料設(shè)計引物序列，以細(xì)胞或組織cDNA為模板，以β-actin作為內(nèi)參。PCR結(jié)果判斷：根據(jù)使用說明調(diào)整基線，將閾值設(shè)定在熒光值對數(shù)圖的線性部分，從軟件中讀取Ct值。

1.5.7Western blot實驗 提取蛋白樣品，蛋白樣品凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入一抗(按照一抗說明書，將100 μl NGS加入10 ml Western一抗稀釋液中混勻)孵育，室溫下震蕩搖床搖動2 h；加入二抗[參考二抗說明書，將Western二抗稀釋液(P0023D) 100 μl加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗10 ml中混勻]孵育，室溫下震蕩搖床搖動2 h，顯影，采用FluorChem FC3凝膠成像數(shù)碼分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析，以積分光密度(IOD)表示灰度值。

1.5.8細(xì)胞葡萄糖消耗和乳酸生成檢測 按照韓文祺 等[6]描述的實驗步驟進(jìn)行。每個樣品重復(fù)測量3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1不同組織中PGAM1的表達(dá)情況免疫組化結(jié)果顯示，宮頸癌組織中PGAM1高表達(dá)率為58.21%，明顯高于癌旁組織(P<0.05)。見表1。

表1 不同組織中PGAM1的表達(dá)情況[n(%)]

2.2兩組患者一般臨床資料比較不同臨床分期、分化程度、浸潤深度的患者PGAM1的高表達(dá)率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其他臨床資料基本一致，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。提示PGAM1高表達(dá)可能與宮頸癌發(fā)生、侵襲、分化等密切相關(guān)。見表2。

表2 宮頸癌患者臨床病理資料與PGAM1表達(dá)的關(guān)系[n(%)]

2.3PGAM1對Hela細(xì)胞增殖活性的影響經(jīng)MTT法檢測，Hela細(xì)胞shPGAM1基因沉默后，與NC組比較，細(xì)胞增殖活性明顯受到抑制，經(jīng)重復(fù)測量方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=98.766，P<0.05)。見圖1。

2.4PGAM1對Hela細(xì)胞凋亡活性的影響細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測，Hela細(xì)胞shPGAM1基因沉默后，與NC組比較，細(xì)胞凋亡率明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=9.706，P<0.05)。見圖2。

2.5PGAM1對Hela細(xì)胞葡萄糖消耗和乳酸產(chǎn)量的影響細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，取上清液，檢測細(xì)胞上清液中葡萄糖含量和乳酸含量，結(jié)果顯示，Hela細(xì)胞shPGAM1基因沉默后，與NC組比較，葡萄糖消耗和乳酸產(chǎn)量均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=16.060、15.926，P<0.05)。見圖3。

圖1 MTT法檢測PGAM1對Hela細(xì)胞增殖的影響與NC組比較：*P<0.05

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測PGAM1對Hela細(xì)胞凋亡的影響與NC組比較：*P<0.05

2.6PGAM1基因沉默對Hela細(xì)胞糖代謝相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的影響磷酸酯酶與張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog，PTEN)、磷酸化絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(phosphorylation auto-ja kuljetusalan，p-Akt)、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)都屬于Akt/mTOR信號通路中的關(guān)鍵分子。通過qRT-PCR法和Western blot法證實，Hela細(xì)胞shPGAM1基因沉默后，與NC組比較，PTEN mRNA和蛋白相對表達(dá)量明顯上調(diào)，而p-Akt、p-mTOR mRNA和蛋白相對表達(dá)量明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

3 討論

在前期研究中，通過高通量基因芯片技術(shù)篩選了與正常宮頸黏膜組織存在表達(dá)差異的宮頸癌組織基因譜，其中PGAM1基因的表達(dá)量明顯上調(diào)，與以往關(guān)于乳腺癌、腎癌、肺癌等組織的研究[7-9]結(jié)果基本一致。說明PGAM1可能參與了腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為調(diào)控。

圖3 PGAM1對Hela細(xì)胞葡萄糖消耗和乳酸產(chǎn)量的影響與NC組比較：*P<0.05

圖4 qRT-PCR法和Western blot法檢測PGAM1對Hela細(xì)胞PTEN、p-Akt、p-mTOR基因和蛋白表達(dá)的影響與NC組比較：*P<0.05

PGAM1是最初在腦組織中發(fā)現(xiàn)的PGAM家族成員之一，定位于人染色體10q25.3區(qū)域，包括PGAM1和PGAM2兩個同源二聚體，既往有研究已經(jīng)證實PGAM1是參與細(xì)胞有氧糖酵解途徑的重要酶之一，可以將3-磷酸甘油酸3位上的磷酸基移位生成2-磷酸甘油酸，從而生成磷酸烯醇式丙酮酸[10]。糖酵解方式是腫瘤細(xì)胞在有氧條件下獲取能量的主要途徑，因此腫瘤細(xì)胞葡萄糖消耗量、糖酵解速率以及乳酸生成量均較正常細(xì)胞明顯增加，這一現(xiàn)象被稱為“Warburg效應(yīng)”。但是在后來很長一段時間，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為Warburg效應(yīng)與腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為關(guān)系不明顯[11]。近幾年，隨著對腫瘤發(fā)生機制的深入發(fā)展，Warburg效應(yīng)重新進(jìn)入人們的視線，逐漸成為腫瘤領(lǐng)域的研究熱點，干擾高糖代謝可能成為抗腫瘤治療的新策略。本研究首先通過免疫組化法探討宮頸癌組織和癌旁組織中PGAM1表達(dá)的差異以及與患者臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果顯示，在癌組織中，PGAM1高表達(dá)率明顯高于癌旁正常黏膜者，并且與患者的臨床分期、分化程度、浸潤深度相關(guān)，提示PGAM1可能參與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、分化、凋亡等惡性生物學(xué)過程。因此PGAM1有可能作為宮頸癌潛在的治療靶標(biāo)。

目前研究證實，腫瘤細(xì)胞的糖代謝需求顯著高于正常細(xì)胞。這一特點使得腫瘤細(xì)胞葡萄糖消耗量和乳酸生成量大大增加，以滿足細(xì)胞的增殖需求[12]。因此本文探討PGAM1與宮頸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，首先從影響腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡著手，進(jìn)一步分析PGAM1基因的生物學(xué)功能。結(jié)果顯示，PGAM1基因敲除后，Hela細(xì)胞凋亡率均明顯增加，增殖活性受到明顯抑制，從而證實PGAM1參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡過程。另外，前期研究通過高通量基因芯片技術(shù)分析表明Akt/mTOR信號通路可能是PGAM1下游靶通路。而Akt/mTOR信號通路已經(jīng)被公認(rèn)為是控制腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為、能量代謝等過程的重要途徑，與Warburg效應(yīng)密切相關(guān)。本研究通過qRT-PCR法和Western blot法初步證實了PGAM1對Akt/mTOR信號通路的調(diào)控影響，結(jié)果顯示，Hela細(xì)胞shPGAM1基因沉默后，PTEN表達(dá)量明顯上調(diào)，而p-Akt、p-mTOR mRNA和蛋白相對表達(dá)量明顯降低。Akt是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，通過磷酸化被激活后移位至胞質(zhì)或胞核中，參與調(diào)控下游靶蛋白mTOR的表達(dá)。而PTEN是Akt/mTOR信號通路的負(fù)性調(diào)控蛋白，具有抑癌基因活性，可抑制腫瘤細(xì)胞增殖，并促使其凋亡。