吳仁森，孟曉源，李 坤,，車立新，郭 瑞

全世界大約有三分之一的人為潛伏性結(jié)核感染者，約有10%的潛伏性結(jié)核感染者會(huì)發(fā)展成活動(dòng)性結(jié)核患者[1]。結(jié)核桿菌最常侵犯的是肺組織，其次是骨與關(guān)節(jié)，約占肺外結(jié)核10%左右。在骨與關(guān)節(jié)結(jié)核中，脊柱結(jié)核約占50%左右[2]。由于脊柱結(jié)核病灶較深，發(fā)病不典型，目前仍沒(méi)有足夠的證據(jù)及指南來(lái)指導(dǎo)脊柱結(jié)核的早期診斷[3]。臨床上，有些脊柱結(jié)核患者癥狀不典型，影像學(xué)上表現(xiàn)也難以和普通脊柱炎性病變及腫瘤相鑒別，這類脊柱結(jié)核被定義為非典型脊柱結(jié)核。關(guān)于非典型脊柱結(jié)核的文獻(xiàn)報(bào)道較少，多以個(gè)案報(bào)道的形式出現(xiàn)[4]，因?yàn)榕R床少見，癥狀及輔助檢查不典型，所以常常耽誤了患者治療的最佳時(shí)機(jī)。血清抗原在結(jié)核病輔助診斷方面一直備受研究人員關(guān)注，尤其在早期快速診斷方面[5]。熱休克蛋白(heat shock proteins，Hsps)作為抗原物質(zhì)，既可以引起細(xì)胞免疫也可以引起體液免疫[6]。該文選取結(jié)核桿菌熱休克蛋白10(Mycobacteriumtuberculosisheat shock protein 10，MTB Hsp 10)、結(jié)核桿菌熱休克蛋白60(Mycobacteriumtuberculosisheat shock protein 60，MTB Hsp 60)、熱休克蛋白16.3(heat shock protein 16.3，Hsp 16.3)和熱休克蛋白70(heat shock protein 70，Hsp 70)4種抗原，通過(guò)ELISA技術(shù)來(lái)評(píng)估其在非典型脊柱結(jié)核輔助診斷上的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1病例資料選取2016年2月～2017年3月新疆自治區(qū)人民醫(yī)院脊柱外科收治的疑似非典型脊柱結(jié)核患者66例。所有患者行術(shù)前穿刺或術(shù)后病理檢查，或行病灶病原菌培養(yǎng)檢查。最終確診為非典型脊柱結(jié)核37例，其中男20例，女17例；年齡16～70(40.8±11.2)歲；脊柱其他疾病26例，其中男14例，女12例；年齡24～57(43.5±10.4)歲；診斷未明確及隨訪丟失共3例(排除試驗(yàn))。以上分組由同一主治醫(yī)師按照一定納入、排除標(biāo)準(zhǔn)完成。另外選取30例健康體檢者做空白對(duì)照組，其中男18例，女12例；年齡20～57(39.6±11.3)歲。非典型脊柱結(jié)核組納入標(biāo)準(zhǔn)：① 單節(jié)段椎骨結(jié)核；② 脊柱附件結(jié)核；③ 多節(jié)段椎骨結(jié)核；④ 無(wú)明顯骨質(zhì)破壞，但伴有冷膿腫形成；⑤ 無(wú)明顯骨質(zhì)破壞，但病理檢查有結(jié)核性肉芽腫；⑥ 術(shù)前或術(shù)后病理檢查符合結(jié)核改變；⑦ 入院前未經(jīng)抗結(jié)核治療，入院后經(jīng)正規(guī)抗結(jié)核治療后，患者癥狀好轉(zhuǎn)或治愈；⑧ 排除合并HIV感染患者；⑨ 全部患者隨訪≥6個(gè)月。脊柱其他疾病組納入標(biāo)準(zhǔn)：① 排除脊柱結(jié)核可能；② 既往無(wú)結(jié)核病病史，無(wú)結(jié)核病家族史、接觸史；③ 排除合并HIV感染患者。本研究經(jīng)過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試人員簽署知情同意書。

1.2試劑結(jié)核桿菌熱休克蛋白(MTB Hsp 10、MTB Hsp 60)和熱休克蛋白(Hsp 70、Hsp 16.3)ELISA檢測(cè)試劑盒由南京森貝伽生物科技有限公司生產(chǎn)提供。

1.3方法自行設(shè)計(jì)信息采集表對(duì)入選受試人員進(jìn)行信息采集，包括入選人員人口學(xué)基本信息，患者臨床特征，入院后患者的實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)結(jié)果。收集受試者靜脈血5 ml，室溫下靜置20 min，3 000 r/min離心20 min，取上清液于-80 ℃冷藏待測(cè)。

采用ELISA技術(shù)檢測(cè)血清中熱休克蛋白。在酶標(biāo)包被板上加入標(biāo)準(zhǔn)品，并稀釋成不同濃度梯度來(lái)設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)濃度。分別在酶標(biāo)包被板剩余孔里加樣品稀釋液和待測(cè)血清樣本，在37 ℃溫箱中溫育30 min后用自動(dòng)洗板機(jī)沖洗5次，拍干后加酶標(biāo)試劑再次溫育、洗滌、拍干。在酶標(biāo)包被板各孔中分別加入顯色劑A、顯色劑B，混勻后放入37 ℃恒溫箱內(nèi)避光顯色15 min。顯色結(jié)束后在酶標(biāo)包被板各孔內(nèi)加入終止液終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀以空白孔調(diào)零，在450 nm波長(zhǎng)下讀取各孔吸光度(optical density，OD)值并做記錄。

2 結(jié)果

2.1入選試驗(yàn)對(duì)象臨床特征及臨床檢驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)入選了66例疑似非典型脊柱結(jié)核患者，隨訪6～12個(gè)月，其中1例最終未明確診斷，2例隨訪丟失，最終有63例患者完成試驗(yàn)。經(jīng)最終確診非典型脊柱結(jié)核37例，有32例患者接受手術(shù)治療，5例保守治療，所有患者接受正規(guī)抗結(jié)核治療10～12個(gè)月；26例其他脊柱疾病患者中，包括脊柱轉(zhuǎn)移瘤11例，化膿性脊柱炎7例，脊柱原發(fā)腫瘤4例，布氏桿菌病4例；30例健康體檢者無(wú)家族結(jié)核病史，無(wú)結(jié)核病接觸史。所有入選對(duì)象均接受臨床特征信息采集及臨床相關(guān)檢驗(yàn)。見表1。

2.2非典型脊柱結(jié)核組患者影像學(xué)特征本組37例患者均接受X線攝片和CT或者M(jìn)RI檢查。主要的影像學(xué)特征有：① X線片表現(xiàn)為骨質(zhì)增生、骨贅形成，椎間隙變窄；② MRI可見椎體軟骨終板破壞，呈蟲蝕樣變化；③ 單一椎體中心病變，或者單一椎體壓縮性病變；④ 單側(cè)椎弓根破壞或者棘突破壞，可累計(jì)多個(gè)部位；⑤ 影像學(xué)表現(xiàn)與癥狀不符，影像學(xué)表現(xiàn)較重，但患者癥狀表現(xiàn)不明顯。

2.34種抗原血清ELISA檢測(cè)結(jié)果93例受試者均接受4種抗原血清ELISA測(cè)定，結(jié)果以酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下讀取各孔OD值體現(xiàn)。非典型脊柱結(jié)核組、脊柱其他疾病組和健康體檢組血清中的4種抗原OD值不全相等(P<0.001)(表2)。非典型脊柱結(jié)核組血清4種抗原OD值要比脊柱其他疾病組和健康體檢組高(P<0.05)，而脊柱其他疾病組和健康體檢組之間4種抗原OD值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 93例入選試驗(yàn)對(duì)象臨床特征信息及臨床檢驗(yàn)結(jié)果

表2 4種抗原ELISA血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果(OD450 nm值

與非典型脊柱結(jié)核組比較：*P<0.05

表3 4種抗原及聯(lián)合診斷AUC、95% CI和約登指數(shù)

2.44種抗原及聯(lián)合診斷對(duì)非典型脊柱結(jié)核的診斷價(jià)值根據(jù)4種抗原的OD值繪制四種抗原及聯(lián)合診斷的ROC曲線(圖1)，根據(jù)ROC曲線計(jì)算4種抗原及聯(lián)合診斷AUC、95%置信區(qū)間(confidence interval，CI)和約登指數(shù)(表3)。MTB Hsp 10診斷靈敏度和特異度分別是87%、73%，MTB Hsp 60是89%、75%，Hsp 16.3是70%、84%，Hsp 70是51%、91%，4種抗原聯(lián)合診斷靈敏度和特異度是89%、98%。

圖1 MTB Hsp 10、MTB Hsp 60、Hsp 70和Hsp 16.3四種抗原及聯(lián)合診斷的ROC曲線

3 討論

在脊柱結(jié)核的早期，脊柱“僵”是一個(gè)重要陽(yáng)性體征[7]。本試驗(yàn)納入的37例非典型脊柱結(jié)核中，有31例出現(xiàn)腰背部肌肉僵硬、鈍痛、叩擊疼等不適癥狀。但這些癥狀不是脊柱結(jié)核特有體征，包括低熱、盜汗、納差、消瘦等癥狀在脊柱化膿性病變和脊柱腫瘤也有發(fā)現(xiàn)。影像學(xué)檢查是脊柱結(jié)核診斷中不可或缺的方法，但在脊柱結(jié)核診斷中X線片的診斷價(jià)值有限，尤其在部分非典型脊柱結(jié)核患者X線片上僅表現(xiàn)為骨質(zhì)增生。CT和MRI在脊柱結(jié)核早期診斷中具有一定價(jià)值，可發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)的細(xì)微變化，尤其是MRI在脊柱結(jié)核早期診斷上具有很高的敏感性。但最終確診仍需病灶組織切片或者細(xì)菌培養(yǎng)。紅細(xì)胞沉降率、C-反應(yīng)蛋白和白細(xì)胞計(jì)數(shù)在感染活動(dòng)期對(duì)結(jié)核診斷有一定指導(dǎo)意義，本研究顯示非典型脊柱結(jié)核組與脊柱其他疾病組比較，紅細(xì)胞沉降率、CRP等炎性指標(biāo)較高，但是紅細(xì)胞沉降率、C-反應(yīng)蛋白主要反應(yīng)炎性反應(yīng)，診斷結(jié)核病特異性差。

由于非典型脊柱結(jié)核所表現(xiàn)出的癥狀不典型，往往更容易被誤診，從而延誤治療的最佳時(shí)機(jī)。如果非典型脊柱結(jié)核早期被診斷并參照一般脊柱結(jié)核的治療原則，將會(huì)達(dá)到和一般脊柱結(jié)核相同的治療效果。所以尋找一種快速、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確的診斷方法非常重要。近年來(lái)對(duì)結(jié)核桿菌抗原上的研究催生了很多對(duì)結(jié)核疾病新的診斷方法。Hsps是具有調(diào)控蛋白降解、耐熱、免疫調(diào)節(jié)等功能的一類抗原蛋白[8]。人在結(jié)核桿菌感染過(guò)程中，Hsps誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，激活Toll樣受體的作用[9]。研究人員利用Hsps這些特性來(lái)研究其對(duì)結(jié)核病診斷作用。

本研究通過(guò)ELISA技術(shù)檢測(cè)人血清中兩種結(jié)核桿菌熱休克蛋白(MTB Hsp 10、MTB Hsp 60)和兩種宿主熱休克蛋白(Hsp 16.3、Hsp 70)在450 nm處OD值顯示，非典型脊柱結(jié)核患者血清中4種抗原OD值明顯高于脊柱其他疾病和健康人。Shekhawat et al[10]通過(guò)檢測(cè)結(jié)核患者腦脊液和血清發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組對(duì)比多種熱休克蛋白均增高。這種變化反映了宿主對(duì)結(jié)核桿菌感染的免疫應(yīng)答，同時(shí)也反映了結(jié)核桿菌自身對(duì)宿主免疫對(duì)抗作用[10]。

通過(guò)繪制四種抗原的ROC曲線，計(jì)算AUC、約登指數(shù)、靈敏度和特異度發(fā)現(xiàn)，MTB Hsp 60的診斷效率最高，雖然MTB Hsp 10和MTB Hsp 60診斷靈敏度較高，但是Hsp 16.3和Hsp 70的診斷特異性較高。聯(lián)合4種抗原繪制ROC曲線，計(jì)算AUC=0.97，靈敏度和特異度分別為89%和98%，可以認(rèn)為聯(lián)合4種抗原對(duì)非典型脊柱結(jié)核診斷效率要高于任意一種單獨(dú)抗原。

本研究也有許多不足之處，如納入樣本量較少，結(jié)核患者均為成年人，沒(méi)有納入兒童非典型脊柱結(jié)核患者，Hsps在兒童脊柱結(jié)核血清中表達(dá)尚不清楚等?？傊\(yùn)用ELISA技術(shù)測(cè)定非典型脊柱結(jié)核患者血清中特異性抗原的含量是一種簡(jiǎn)單、快速、廉價(jià)的結(jié)核診斷方法，MTB Hsp10、MTB Hsp60、Hsp16.3和Hsp70 4種抗原在非典型脊柱結(jié)核輔助診斷中具有一定價(jià)值。