李 彬,薛 昀

目前肺癌主要的治療方法為手術(shù)、放化療及生物靶向治療等綜合治療，而患者的主要死亡原因是腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。研究[1-2]表明，阿片類藥物對(duì)腫瘤的發(fā)展有一定的影響，其中μ受體及其激動(dòng)劑可能促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)；而κ受體激動(dòng)劑則抑制腫瘤生長(zhǎng)。腫瘤患者在圍術(shù)期鎮(zhèn)痛及癌痛治療中嗎啡作為鎮(zhèn)痛藥物“金標(biāo)準(zhǔn)”被大量使用。嗎啡為μ受體激動(dòng)劑，是否促進(jìn)腫瘤的侵襲及遷移；布托啡諾為κ受體激動(dòng)劑是否抑制腫瘤的侵襲及遷移，目前這一領(lǐng)域的研究資料還較少，且研究方法不統(tǒng)一[3-4]。同時(shí)新型的阿片類藥物開始用于臨床麻醉和鎮(zhèn)痛，對(duì)腫瘤的短期作用和長(zhǎng)期影響亟待研究。該研究旨在探討嗎啡與布托啡諾對(duì)人肺腺癌細(xì)胞A549的侵襲及遷移的影響，以及對(duì)相關(guān)蛋白表達(dá)的作用機(jī)制，期望有助于優(yōu)化臨床用藥習(xí)慣及改善肺癌患者術(shù)后生存。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)對(duì)象及分組人肺腺癌A549細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫，接種于培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后，隨機(jī)分為嗎啡組與布托啡諾組。每組分別設(shè)置不同濃度組：對(duì)照組(生理鹽水)、0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L。同時(shí)在嗎啡組與布托啡諾組的基礎(chǔ)上分別設(shè)置兩組對(duì)應(yīng)的特異性拮抗劑組：?jiǎn)岱?甲基納曲酮，布托啡諾+Nor-Binaltorphimine (Nor-BNI)；鹽酸嗎啡注射液(東北制藥集團(tuán)沈陽第一制藥有限公司，1 ml ∶10 mg，國藥準(zhǔn)字H20013351)；甲基納曲酮(上海意杰生物科技有限公司，5 mg，國藥準(zhǔn)字A3596)；布托啡諾注射液(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，2 ml ∶4 mg，國藥準(zhǔn)字H20143106)；Nor-BNI(博奧派克生物，10 mg，貨號(hào)ab120078)。每組分別加入對(duì)應(yīng)濃度藥物后孵育36 h，檢測(cè)其侵襲及遷移能力。

1.2試劑與儀器胎牛血清(FBS)購自美國Hyclone公司；RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液購自美國GibcoBRL公司；二甲基亞砜(DMSO，分析純)購自江蘇鴻聲化工廠；Western blot試劑(抗體稀釋液和抗體去除液)、免疫熒光試劑(細(xì)胞核熒光染液DAPI)購自上海碧云天公司；ECL發(fā)光液購自美國Thermo Scientific公司；免疫組化試劑(SP9000通用型組化試劑盒、DAB顯色劑)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；蘇木精、伊紅等染色液及Triton X-100購自北京索萊寶生物公司；PVDF膜(0.45 μm)購自美國Millipore公司；3111型CO2培養(yǎng)箱、CL17R型冷凍高速離心機(jī)購自美國Thermo Forma公司；低溫冰箱購自臺(tái)灣SANYO公司；SENCO R-201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購自上海中順生物科技有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)板和培養(yǎng)瓶購自丹麥NUN CLON公司；XPS-18型倒置熒光顯微鏡購自日本Olympus公司；Western blot檢測(cè)系統(tǒng)與凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司；Leica Bond-Max免疫組化儀購自北京昊諾斯科技有限公司(德國生產(chǎn))。

1.3Transwell法檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力將凍存于-20 ℃的Matrigel與無血清培養(yǎng)液1 ∶6稀釋，每孔15 μl加入Transwell小室，37 ℃靜置1 h。轉(zhuǎn)染24 h消化后，1 000 r/min離心1 min，去上清液，加入各組無血清培養(yǎng)液及1×105個(gè)細(xì)胞，用DMEM稀釋至400 μl，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。向小室下層加入含10% FBS DMEM的600 μl培養(yǎng)液，培養(yǎng)在含5% CO2、37 ℃恒溫箱24 h。然后吸去嵌室內(nèi)液體，用PBS洗3次，加入90%乙醇固定30 min，吸出乙醇后PBS洗2次，用0.1%結(jié)晶紫染色30 min，風(fēng)干后，熒光顯微鏡下(×200)隨機(jī)選擇5個(gè)視野拍照并計(jì)平均數(shù)。

1.4細(xì)胞劃痕法檢測(cè)細(xì)胞遷移將A549細(xì)胞接種到6孔板，細(xì)胞密度為鋪滿培養(yǎng)板80%時(shí)轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染6 h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)板，用20 μl槍頭垂直于細(xì)胞平面劃痕，用PBS洗5次，洗去細(xì)胞殘留，更換培養(yǎng)基，以劃痕時(shí)間點(diǎn)記做0 h，每隔12 h拍照。各樣品均取5個(gè)視野測(cè)量距離。細(xì)胞遷移率(%)=(0 h時(shí)劃痕距離-24 h時(shí)劃痕距離)/0 h時(shí)劃痕距離×100%。

1.5Westernblot實(shí)驗(yàn)每組1×107個(gè)細(xì)胞，加入預(yù)冷蛋白裂解液200 μl，4 ℃下裂解1 h，冰浴下超聲裂解15 min，12 000 r/min離心20 min，上清液用BCA定量試劑盒測(cè)定基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)-2、MMP-9、成束蛋白(Fascin)的濃度。利用8% SDS-PAGE電泳50 μg總蛋白，轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂牛奶封閉1 h后加入1 ∶1 000稀釋的小鼠抗人單克隆抗體，4 ℃孵育12 h。接著TBST清洗3次，每次10 min，加入1 ∶3 000稀釋的山羊抗小鼠HRP標(biāo)記二抗，重復(fù)以上清洗，最后采用Pierce公司生產(chǎn)的超敏ECL試劑暗室曝光檢測(cè)蛋白條帶。

2 結(jié)果

2.1布托啡諾和嗎啡對(duì)A549細(xì)胞侵襲能力的影響與對(duì)照組比較，隨著布托啡諾劑量的增加，A549細(xì)胞侵襲數(shù)明顯減少，而隨著嗎啡劑量的增加A549細(xì)胞侵襲數(shù)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明布托啡諾可抑制肺腺癌細(xì)胞的侵襲能力，而嗎啡反之。見圖1。

2.2各組細(xì)胞培養(yǎng)0、12、24h的遷移情況比較與對(duì)照組比較，隨著布托啡諾劑量的增加及時(shí)間延長(zhǎng)，A549細(xì)胞遷移變化不明顯，而隨著嗎啡劑量的增加A549細(xì)胞遷移數(shù)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明布托啡諾可抑制肺腺癌細(xì)胞的遷移能力，而嗎啡反之。見表1和圖2、3。

表1 各組細(xì)胞遷移率的比較

與對(duì)照組比較：*P<0.05；與0.1 μmol/L比較：#P<0.05；與1 μmol/L比較：△P<0.05

圖1 布托啡諾與嗎啡對(duì)A549細(xì)胞侵襲能力的影響 ×200A：布托啡諾；B：?jiǎn)岱龋?：對(duì)照組；2：0.1 μmol/L;C:1 μmol/L;D:10 μmol/L

圖2 各組細(xì)胞培養(yǎng)0、12、24 h的遷移情況比較 ×100A：布托啡諾；B：?jiǎn)岱?/p>

圖3 各組細(xì)胞遷移率的比較

2.3Transwell法檢測(cè)加入拮抗劑各組的侵襲能力與對(duì)照組比較，隨著布托啡諾特異性拮抗劑Nor-BNI劑量為0.1 μmol/L時(shí)，A549細(xì)胞侵襲數(shù)明顯增加，而1 μmol/L與10 μmol/L的劑量變化不明顯。與單純布托啡諾組對(duì)應(yīng)的劑量比較，可明顯觀察到加入Nor-BNI后，每組對(duì)應(yīng)劑量的A549細(xì)胞侵襲數(shù)明顯增加。與單純嗎啡組對(duì)應(yīng)的劑量比較，隨著嗎啡特異性拮抗劑甲基納曲酮?jiǎng)┝康脑黾樱珹549細(xì)胞侵襲數(shù)明顯減少。結(jié)果表明布托啡諾可抑制肺腺癌細(xì)胞的侵襲能力，而嗎啡反之。見圖4。

圖4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)培養(yǎng)24 h布托啡諾+Nor-BNI與嗎啡+甲基納曲酮對(duì)A549細(xì)胞侵襲能力的影響 ×200A：布托啡諾+Nor-BNI；B：?jiǎn)岱?甲基納曲酮；1：對(duì)照組；2：0.1 μmol/L;C:1 μmol/L;D:10 μmol/L

2.4Westernblot檢測(cè)MMP-2、MMP-9、Fascin蛋白的表達(dá)與對(duì)照組比較，10 μmol/L布托啡諾作用肺腺癌A549細(xì)胞24 h后，MMP-2、MMP-9、Fascin蛋白表達(dá)下調(diào)，而嗎啡作用后MMP-2、MMP-9、Fascin蛋白表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明布托啡諾可以抑制肺腺癌細(xì)胞的遷移能力，而嗎啡反之。見圖5、6、表2。

圖5 Western blot法檢測(cè)各穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系MMP-2、MMP-9、Fascin蛋白的表達(dá)

圖6 10 μmol/L布托啡諾與嗎啡作用肺腺癌A549細(xì)胞24 h后MMP-2、MMP-9、Fascin蛋白的表達(dá)

表2 10 μmol/L布托啡諾與嗎啡作用肺腺癌A549細(xì)胞24 h后MMP-2、MMP-9、Fascin蛋白的表達(dá)

t1、P1：10 μmol/L嗎啡與對(duì)照組比較；t2、P2：10 μmol/L布托啡諾與對(duì)照組比較

3 討論

研究[5]顯示術(shù)后阿片類藥物的使用可能會(huì)增加癌癥的復(fù)發(fā)，降低Ⅰ期和IIa期非小細(xì)胞型肺癌(NSCLC)患者的存活率。另一項(xiàng)研究[6]也表明術(shù)后μ受體激動(dòng)劑可降低整體生存率和早期NSCLC患者的無病生存時(shí)間。然而，Cata et al[7]卻發(fā)現(xiàn)靜脈或者硬膜外鎮(zhèn)痛的NSCLC患者在2年或5年生存率方面沒有顯著差異。目前，阿片類受體激動(dòng)劑是目前最常用的癌癥慢性疼痛及圍手術(shù)期的止痛藥，如嗎啡為阿片μ受體激動(dòng)藥，而布托啡諾則是κ受體激動(dòng)劑。對(duì)于μ受體激動(dòng)劑而言，一方面可通過抑制機(jī)體免疫力，同時(shí)促進(jìn)術(shù)后殘留癌細(xì)胞的存活而增加癌癥復(fù)發(fā)率；對(duì)于κ受體激動(dòng)劑而言，可能通過降低肺癌細(xì)胞糖原合成激酶3β的磷酸化從而抑制NSCLC細(xì)胞生長(zhǎng)[8]。近年來，阿片類鎮(zhèn)痛藥物對(duì)肺癌的作用機(jī)制受到國內(nèi)外關(guān)注，但爭(zhēng)議較大[9]。研究[10]顯示嗎啡、布托啡諾等對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲有一定的影響，并表明不同的麻醉藥物及濃度對(duì)不同類型的腫瘤細(xì)胞的影響差異較大。本研究顯示，隨著嗎啡濃度的增加對(duì)促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞A549的侵襲和遷移能力逐漸增強(qiáng)。

目前MMP家族中明膠酶MMP-2、MMP-9是研究較普遍的2種[8]。研究[9]表明，MMP-2、MMP-9的表達(dá)對(duì)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移有影響。嗎啡在腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移中的作用仍存在較多爭(zhēng)議，有促進(jìn)或抑制轉(zhuǎn)移侵襲的結(jié)果[11]，而布托啡諾多用于胃癌、肝癌、食管癌等術(shù)后自控鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜，在腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲方面國內(nèi)沒有相關(guān)報(bào)道。本研究顯示，嗎啡促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞A549的侵襲和遷移，并上調(diào)了MMP-2、MMP-9的表達(dá)；而布托啡諾反之，這與阿片類藥物μ受體及其激動(dòng)劑可能促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)；而κ受體激動(dòng)劑則抑制腫瘤生長(zhǎng)較一致。成束蛋白Fascin在腦、卵巢等組織中呈高表達(dá)，其在不同類型細(xì)胞中表達(dá)不同[12]。韓鐵鵬 等[13]發(fā)現(xiàn)無論鱗癌還是腺癌，F(xiàn)ascin蛋白高表達(dá)與腫瘤的分期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和患者預(yù)后顯著相關(guān)，而且Fascin蛋白高表達(dá)是早期NSCLC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本研究顯示，嗎啡明顯上調(diào)了肺腺癌細(xì)胞A549中Fascin蛋白的表達(dá)；而布托啡諾反之，而具體的作用機(jī)制需研究藥物作用的藥代動(dòng)力學(xué)、靶點(diǎn)相關(guān)基因表達(dá)及相關(guān)蛋白受體的表達(dá)，阿片μ受體的多態(tài)性，同時(shí)學(xué)習(xí)μ受體和κ受體表達(dá)的表達(dá)水平對(duì)于不同患者肺癌預(yù)后的影響[11]。

Oosten et al[14]研究了癌癥患者嗎啡代謝的藥代動(dòng)力學(xué)表明，血藥濃度與治療結(jié)果呈正相關(guān)性。Afsharimani et al[15]認(rèn)為所用模型間差異導(dǎo)致目前嗎啡對(duì)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲性的差異性結(jié)論。本研究顯示，嗎啡促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞A549的侵襲和遷移，而布托啡諾反之，這與阿片類藥物μ受體及其激動(dòng)劑可能促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，而K受體激動(dòng)劑則抑制腫瘤生長(zhǎng)較一致。這不排除其是共同作用的通路，但具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。同時(shí)，本研究在不同濃度的嗎啡與布托啡諾中加入對(duì)應(yīng)的特異性拮抗劑，顯示布托啡諾可抑制肺腺癌細(xì)胞的侵襲能力，而嗎啡反之。

綜上所述，嗎啡可促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞A549的遷移與侵襲，而布托啡諾則抑制肺腺癌細(xì)胞A549的遷移與侵襲，可能與MMP-2、MMP-9、Fascin蛋白表達(dá)相關(guān)，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步探究。