袁 錦，紀(jì)冬梅，鄒薇薇，武龍梅，章志國，曹云霞

近年來隨著哺乳動(dòng)物核移植技術(shù)的發(fā)展和完善，人們對(duì)極體功能的探究也逐步深入[1-2]。1998年至今，科學(xué)家先后以小鼠、豬和人為研究模型，證實(shí)第一極體染色體具有參與胚胎發(fā)育的能力，確認(rèn)了第一極體基因組移植的可行性[3-6]，認(rèn)為其在卵子缺陷所致的不孕不育治療、線粒體遺傳病治療等方面具有較為廣泛的再利用價(jià)值[7-9]。但對(duì)第一極體應(yīng)用效率尚未深入探究。該研究旨在探討第一極體從剛排出到趨于退化過程中，各個(gè)時(shí)間段的小鼠第一極體是否都可以參與構(gòu)建重構(gòu)卵子并重獲正常受精和發(fā)育的能力；同時(shí)篩選出第一極體基因組移植的最佳時(shí)間窗。為深入挖掘哺乳動(dòng)物第一極體生殖潛力，提高第一極體再利用效率提供一定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1動(dòng)物 清潔級(jí)BDF1雜交鼠共20只，6～8周齡，體質(zhì)量20～28 g，購自南京大學(xué)南京生物醫(yī)藥研究院。

1.1.2試劑和耗材 Gamete培養(yǎng)液(脫除顆粒細(xì)胞后洗滌卵子和顯微操作液所需)、Fertilization培養(yǎng)液、Cleavage培養(yǎng)液(受精卵的體外培養(yǎng)所需)均購自澳大利亞COOK公司。細(xì)胞松弛素B(cytochalasin B,CB)(取出紡錘體染色體復(fù)合物前處理卵子所需)、透明質(zhì)酸酶(脫除卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合物的顆粒細(xì)胞所需)均購自美國Sigma公司。7%聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone，PVP)(顯微操作液所需)購自美國Sage公司。孕馬血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin，PMSG)、人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG)(超促排卵所需)均購自寧波第二激素廠。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1超促排卵 將BDF1雌鼠隨機(jī)分組，供核組小鼠均于20:00注射PMSG(7.5 IU/只)，間隔48 h后注射hCG(7.5 IU/只)。供胞質(zhì)組小鼠分別于18：30、19：30、20：30、21：30注射PMSG(7.5 IU/只)，間隔48 h后分別注射hCG(7.5 IU/只)。

1.2.2MII卵母細(xì)胞的采集 核供體MII卵子的獲?。侯i椎脫臼法分別處死hCG后12.5、13.5、14.5、15.5 h的4組F1雌鼠，手術(shù)剪下輸卵管置于gamete液滴中，體視鏡下用尖鑷子撕開輸卵管壺腹部，獲取卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合物，將卵冠丘復(fù)合物置于透明質(zhì)酸酶中，37 ℃消化3 min，用移卵針輕輕吹吸脫除顆粒細(xì)胞，獲取MII裸卵。將MII裸卵置于gamete液滴中洗滌5次洗去透明質(zhì)酸酶，移入cleavage液滴中，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中備用。

胞質(zhì)供體MII卵子的獲?。侯i椎脫臼法處死hCG后14 h的F1母鼠，以上述相同的方法獲取MII卵子備用。

1.2.3胞質(zhì)供體卵子去核 將供胞質(zhì)的卵子移入含5 μg/ml CB的gamete操作液滴中,置于37 ℃恒溫板上，處理10 min，將紡錘體區(qū)域調(diào)整至3點(diǎn)鐘方向后，用持卵針固定卵子，使用激光破膜儀在3點(diǎn)鐘位置給透明帶打孔。用內(nèi)徑10 μm的去核針通過透明帶破口，輕輕吸出紡錘體棄去。收集去核后的卵子備用。

1.2.4第一極體的獲取 將供核的卵子移入gamete操作皿中，置于37 ℃恒溫板上，調(diào)整至極體位于12點(diǎn)鐘方向，用持卵針固定卵子，使用激光破膜儀在2點(diǎn)鐘位置給透明帶打孔，用內(nèi)徑8 μm的注射針吸取第一極體備用。

1.2.5卵母細(xì)胞的重組 將注射針中的極體輕輕吹出吸回，以確定極體包膜已破，注射針通過3點(diǎn)鐘方向的透明帶破口，將第一極體注入已去核的胞質(zhì)供體卵子內(nèi)，輕輕退針，獲得第一極體基因組移植重構(gòu)卵子。將重構(gòu)卵子移入cleavage培養(yǎng)皿，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中恢復(fù)。

1.2.6重構(gòu)卵子的體外受精和培養(yǎng) 從F1公鼠附睪尾和輸精管中獲取精子，移入fertilization培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行獲能。精子獲能大于1 h后，向預(yù)先準(zhǔn)備好的各個(gè)體外受精液滴中加入適量精子，分別移入各組重構(gòu)卵。5 h后觀察受精情況。洗脫精子后移入cleavage培養(yǎng)皿，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行后續(xù)培養(yǎng)。

1.2.7對(duì)照組卵子的體外受精和培養(yǎng) 獲取MII卵子，脫除顆粒細(xì)胞后移入fertilization培養(yǎng)液滴中，加入適量源自F1公鼠的已獲能的精子。5 h后觀察受精情況。洗脫精子后移入cleavage培養(yǎng)皿，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行后續(xù)培養(yǎng)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)經(jīng)Prism 6.0 (GraphPad)軟件處理，重構(gòu)胚存活率、受精率、2細(xì)胞形成率、4細(xì)胞形成率和囊胚率的比較均使用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1不同時(shí)間PB1T重構(gòu)胚制備成功率和體外受精情況根據(jù)表1、圖1A和圖2可見，hCG后12.5、13.5、14.5、15.5 h的卵子排出的第一極體作為核供體，PB1T重構(gòu)胚存活率與對(duì)照組(100.0%)比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(88.0%、92.0%、92.3%、89.3%，P>0.05)，其中13.5 h和14.5 h組存活率高于其他實(shí)驗(yàn)組。根據(jù)表1和圖1B可見，12.5、13.5、14.5 h組體外受精率和對(duì)照組(87.5%)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(81.8%、91.3%、83.3%,P>0.05)，其中13.5 h組體外受精率在實(shí)驗(yàn)組中最高。15.5 h組重構(gòu)卵子的體外受精率為76%，在實(shí)驗(yàn)組中最低，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.020 0)。

2.2不同時(shí)間第一極體移植重構(gòu)胚體外發(fā)育情況根據(jù)表1和圖1C、D、E可見，13.5 h組重構(gòu)胚的2細(xì)胞、4細(xì)胞以及囊胚形成率分別為95.2%、95.0%和84.2%，在實(shí)驗(yàn)組中均最高。與對(duì)照組(100%)相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。12.5 h組重構(gòu)胚的2細(xì)胞、4細(xì)胞以及囊胚形成率為83.3%、80.0%、75%,14.5 h組重構(gòu)胚的2細(xì)胞、4細(xì)胞以及囊胚形成率為85.0%、88.2%、73.3%，這兩組與對(duì)照組相比(100.0%、95.2%、90.0%)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。15.5 h組重構(gòu)胚的2細(xì)胞和4細(xì)胞形成率為89.5%和70.6%，與其他組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其囊胚形成率為41.7%，在實(shí)驗(yàn)組中最低，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.005 7)。

表1 重構(gòu)胚的體外受精和發(fā)育情況 [n(%)]

與對(duì)照組比較：*P<0.05**P<0.01

圖1 不同時(shí)間PB1T重構(gòu)胚的體外存活和發(fā)育情況

A：不同時(shí)間PB1T重構(gòu)胚的存活率(存活數(shù)/卵子數(shù))；B：不同時(shí)間PB1T重構(gòu)胚的體外受精率(受精數(shù)/存活數(shù))；C：不同時(shí)間PB1T重構(gòu)胚的2細(xì)胞形成率(2細(xì)胞數(shù)/受精數(shù))；D：不同時(shí)間PB1T重構(gòu)胚的4細(xì)胞形成率(4細(xì)胞數(shù)/2細(xì)胞數(shù))；E：不同時(shí)間PB1T重構(gòu)胚的囊胚率(囊胚數(shù)/4細(xì)胞數(shù))；與對(duì)照組比較：*P<0.05**P<0.01

圖2 第一極體基因組移植重構(gòu)胚發(fā)育圖 ×200A：重構(gòu)受精卵；B：重構(gòu)胚分裂為2細(xì)胞；C：重構(gòu)胚分裂為4細(xì)胞；D：重構(gòu)胚發(fā)育成囊胚

2.3不同時(shí)間第一極體形態(tài)變化如圖3所示，hCG后12.5 h大多卵子剛開始排出的第一極體，此時(shí)間點(diǎn)第一極體呈扁橢圓體，邊界清晰，沒有與卵胞質(zhì)完全分離。如圖4A所示，部分第一極體中的染色體與胞質(zhì)中染色體沒有徹底分離。hCG后13.5 h時(shí)，第一極體與卵胞質(zhì)完全分離。呈較為飽滿的橢圓體，邊界清晰。卵周間隙稍變大。hCG后14.5 h，第一極體開始向圓球體變化，卵周間隙進(jìn)一步變大。hCG后15.5 h，第一極體膨脹呈球體，邊界開始淡化，逐漸趨于瓦解退化。

圖3 不同時(shí)間的第一極體形態(tài) ×200A:hCG后12.5 h的第一極體；B: hCG后13.5 h的第一極體；C: hCG后14.5 h的第一極體；D: hCG后15.5 h的第一極體

圖4 不同時(shí)間的第一極體染色體與胞質(zhì)中紡錘體分離情況 ×200A:hCG后12.5 h的MII卵子；B:hCG后13.5 h的MII卵子；C:hCG后14.5 h的MII卵子；D. hCG后15.5 h的MII卵子

3 討論

雖然科學(xué)家在前期研究中已經(jīng)證實(shí)，第一極體的基因組具有支持重構(gòu)卵子正常受精、發(fā)育并獲得子代的生殖能力。對(duì)極體功能的認(rèn)識(shí)獲得了突破性的進(jìn)展。但是，因?yàn)樾∈蟮谝粯O體排出后存活時(shí)間很短，在進(jìn)行第一極體基因組移植的研究中，第一極體的選擇和分離時(shí)間窗是實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵因素。是否所有時(shí)間段的第一極體都可以作為移植核供體，何時(shí)最適宜進(jìn)行第一極體基因組移植，前期報(bào)道尚未對(duì)此進(jìn)行深入探究。由于第一極體排出后，留在卵母細(xì)胞胞質(zhì)中染色體一直處于第二次減數(shù)分裂中期階段，而第一極體會(huì)逐漸走向退化消散[10]。設(shè)想最早剛剛從初級(jí)卵母細(xì)胞中排出的最新鮮的第一極體可以更好地保持與卵母細(xì)胞胞質(zhì)環(huán)境的同步性，其染色體活性更利于重構(gòu)卵子的存活和后續(xù)發(fā)育。因此，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)極體從剛剛排出即hCG后12.5 h到趨于退化消散即hCG后15.5 h的生理狀態(tài)和時(shí)間跨度，設(shè)立了4個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行探究。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，從hCG后12.5 h到15.5 h，4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的小鼠第一極體作為核供體，都可以成功構(gòu)建重構(gòu)卵子，正常受精，卵裂發(fā)育至囊胚。說明這4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的第一極體染色體在被移入去核的卵母細(xì)胞胞質(zhì)中后，均可以快速經(jīng)歷凝集重構(gòu)和調(diào)控細(xì)胞周期的重新編程，支持卵母細(xì)胞的后續(xù)發(fā)育。但實(shí)驗(yàn)過程中顯示，12.5 h大部分第一極體剛剛排出，呈扁橢圓形，與胞質(zhì)沒有完全分離。由于胞質(zhì)骨架蛋白的牽拉作用，在取第一極體的操作過程中，經(jīng)常會(huì)將胞質(zhì)中的染色體和部分胞質(zhì)連帶同時(shí)取出，無法徹底分離。造成12.5 h組第一極體的獲取效率較低。雖然12.5 h組存活的重構(gòu)卵子在后續(xù)的體外受精率、卵裂率和囊胚形成率上與對(duì)照組沒有顯著差異?？梢哉J(rèn)為，對(duì)于剛剛排出的最新鮮的第一極體，其染色體發(fā)育階段可以很好的與卵母細(xì)胞胞質(zhì)保持同步性。但是此時(shí)間點(diǎn)第一極體染色體分離率低，導(dǎo)致操作成功率低下，因此該時(shí)間點(diǎn)不是第一極體基因組移植的最佳選擇。

15.5 h組第一極體已經(jīng)趨于退化，極體包膜逐漸變淡，極體胞質(zhì)變粗糙。此時(shí)的第一極體基因組雖然可以支持重構(gòu)卵母細(xì)胞受精和發(fā)育，但受精率顯著低于其他組。囊胚生成率也顯著低于對(duì)照組。不適宜選作第一極體基因組移植的時(shí)間窗。

相比之下，13.5 h和14. 5 h組的第一極體作為核供體，構(gòu)建重構(gòu)卵子的存活率、體外受精率、卵裂率和囊胚形成率與對(duì)照組相比沒有顯著差異。說明在這兩個(gè)時(shí)間窗內(nèi)，第一極體染色體的發(fā)育狀態(tài)與卵母細(xì)胞胞質(zhì)依舊保持較好的同步性。重構(gòu)卵母細(xì)胞可以順利重新編程，進(jìn)而進(jìn)行受精，第二次減數(shù)分裂和卵裂等發(fā)育過程。因此，可以認(rèn)為hCG后13.5～14.5 h是小鼠第一極體基因組移植的最佳時(shí)間窗。

在培養(yǎng)過程中，還發(fā)現(xiàn)各組PB1T重構(gòu)胚的2細(xì)胞、4細(xì)胞以及囊胚生成時(shí)間均遲于對(duì)照組。受精后早期胚胎發(fā)育主要依賴于母性遺傳的胞質(zhì)RNA和蛋白質(zhì)調(diào)控[11]。因此重構(gòu)胚的發(fā)育出現(xiàn)遲緩現(xiàn)象，可能是由于第一極體被注入胞質(zhì)供體卵子時(shí)，會(huì)帶入少量同源胞質(zhì)，染色體對(duì)異源胞質(zhì)環(huán)境需要適應(yīng)過程，對(duì)同源與異源胞質(zhì)的調(diào)控先后次序和協(xié)調(diào)性存在調(diào)整過程。胞質(zhì)狀態(tài)也是重構(gòu)胚發(fā)育遲緩的另一關(guān)鍵因素。胞質(zhì)供體在去核時(shí)需要經(jīng)歷CB的處理，CB會(huì)增加胞質(zhì)柔韌性，降低去核操作時(shí)卵子的死亡率，但也會(huì)抑制胞質(zhì)中微絲微管的形成，影響重組卵母細(xì)胞的正常受精和發(fā)育[12]。因此，去核完成后，應(yīng)注意延長洗滌次數(shù)和時(shí)間以徹底洗滌CB。即使殘留少量的CB 也可能對(duì)重構(gòu)卵子的正常受精、卵裂產(chǎn)生很大的影響。除此之外，顯微操作對(duì)卵子的損傷，操作過程中的溫度變化，培養(yǎng)試劑成分的優(yōu)化，胞質(zhì)供體卵子去核時(shí)帶出的胞質(zhì)量等均對(duì)移植成功率和后續(xù)發(fā)育率存在影響[13-15]。