黃紹代，王 玉，魯長風(fēng)，陳 鵬，王 沖，劉雪劍，孫百川，張凱紅，荊曉光，胡 丹，彭 江，田建偉,2

干細(xì)胞移植技術(shù)的廣泛研究，為臨床上治療各種疾病提供了新的思路。而種子細(xì)胞的選擇是干細(xì)胞移植的基本要素，脂肪干細(xì)胞具有來源豐富、取材方便、對供體損傷小、增殖分化能力強等優(yōu)勢，是目前干細(xì)胞移植的理想選擇。很多預(yù)臨床實驗都證實脂肪干細(xì)胞對缺血性心臟病有一定的治療效果[1-2]，但對于干細(xì)胞植入體內(nèi)后的轉(zhuǎn)歸以及干細(xì)胞發(fā)揮作用的機制仍然不是很明確[3]。因此，提供一個簡單高效的干細(xì)胞標(biāo)志方法，研究干細(xì)胞移植后在體內(nèi)的存活率、遷移轉(zhuǎn)歸和分布已成為干細(xì)胞移植研究領(lǐng)域的熱點之一。而一個好的細(xì)胞標(biāo)志物需具備不易洗脫、不易被代謝、標(biāo)記后的信號容易被檢測等特點[4]。PKH26是目前應(yīng)用較多的一種親脂性細(xì)胞標(biāo)志物，已有文獻(xiàn)[5-6]報道了PKH26用于示蹤間充質(zhì)干細(xì)胞以及神經(jīng)干細(xì)胞的研究。該研究探討PKH26熒光素染料對脂肪干細(xì)胞的生物學(xué)特性的影響，為進(jìn)一步研究干細(xì)胞的遷移轉(zhuǎn)歸及示蹤提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗動物SPF級新生SD大鼠8只，雌雄不限，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供。

1.2實驗試劑和設(shè)備PKH26熒光染料/二型膠原酶(美國Sigma公司)；低糖DMEM/胎牛血清(美國CORNING公司)；PBS(中國索萊寶公司)；雙抗(美國Gibco公司)； CD45/CD11b(美國BD公司)；CD34/CD29/CD44/CD105(英國Abcam公司)；成脂誘導(dǎo)液/成骨誘導(dǎo)液/成軟骨誘導(dǎo)液 (中國Cyagen公司)；CCK8試劑盒(日本DOJINDO公司)；流式細(xì)胞儀(型號:FACSCelesta,美國BD公司)；微量孔板分光光度計(型號：EPOCH TAKE3，美國Biotek公司)；DP70熒光顯微鏡、IX70倒置相差顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；YT-CJ-2NB超凈工作臺(北京亞泰公司)；低速臺式離心機(北京白洋公司)。

1.3實驗方法

1.3.1脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose derived mesenchymal stem cells,ADSCs)的分離培養(yǎng) 取新生SD大鼠8只，雌雄不限，浸泡于體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇溶液中5 min，移入超凈工作臺，乙醚麻醉，小心剝離腹股溝區(qū)的皮下脂肪組織，用眼科剪小心剝除筋膜組織，轉(zhuǎn)移至PBS溶液中清洗2～3次，將洗凈的脂肪組織轉(zhuǎn)移至青霉素小瓶中，用眼科剪剪成 1～3 mm3，加入8 ml 0.1%的二型膠原酶，置于磁力攪拌器37 ℃消化30～40 min。加入培養(yǎng)液終止消化，1 700 r/min離心 5 min，棄上清液，用配制好的低糖DMEM培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶中，放置于37 ℃體積分?jǐn)?shù)5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。48 h后換液去除未貼壁的細(xì)胞，細(xì)胞達(dá)80%融合時，用0.25%的胰酶消化傳代，按1 ∶3比例進(jìn)行擴(kuò)增傳代。

1.3.2PKH26標(biāo)記ADSCs 胰酶消化P2代的ADSCs形成2×107個/cm2的細(xì)胞懸液，加入無血清培養(yǎng)基，800 r/min離心5 min，吸棄上清液，使剩余液體低于25 μl，加入1 ml 試劑盒中稀釋液C，制備完全離散的細(xì)胞懸液。配制染色液：將4 μl的PKH26乙醇染料加入離心管中，再加入1 ml 稀釋液C制備染料溶液。盡快將離散的1 ml細(xì)胞懸液加入到配好的染液中，并用吸管均勻快速的混合，常溫孵育2～5 min，可輕輕顛倒混勻。加入2 ml的血清孵育1 min終止染色，再用4 ml含血清培養(yǎng)基稀釋終止的反應(yīng)液，800 r/min離心10 min，吸棄上清液。再加入10 ml完全培養(yǎng)基，重復(fù)離心2次，每次800 r/min離心5 min，最后用10 ml完全培養(yǎng)基重懸到所需濃度，用合適的細(xì)胞濃度接種于培養(yǎng)瓶中，第2天在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞被標(biāo)記的情況。

1.3.3ADSCs的免疫表型分析 胰酶消化P2代的ADSCs制成細(xì)胞懸液，加入無血清培養(yǎng)基，800 r/min離心5 min，再用無血清培養(yǎng)基按照5.0×105個/ml密度進(jìn)行重懸，吸取1 ml細(xì)胞懸液分別加入到7個15 ml聚丙烯離心管中，800 r/min離心5 min，吸棄上清液，留下約200 μl的液體，加入CD34-APC、CD45-PE、CD29-PE、CD44-APC、CD105-APC、CD11b-FITC室溫避光孵育20 min，加入PBS清洗未結(jié)合抗體，用流式細(xì)胞儀檢測各抗體的表達(dá)情況。

1.3.4ADSCs成脂誘導(dǎo)及鑒定 胰酶消化P2代PKH26標(biāo)記和未標(biāo)記的ADSCs,以2×104個/cm2的密度接種于六孔板中，每孔加入2 ml低糖DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，吸棄完全培養(yǎng)液，每孔加入2 ml配好的成脂誘導(dǎo)A液(A液基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗、谷氨酰胺、胰島素、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、羅格列酮、地塞米松)，誘導(dǎo)3 d后，吸掉六孔板中的A液，加入2 ml配好的成脂誘導(dǎo)B液(B液基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗、谷氨酰胺、胰島素)，24 h后，吸棄B液，換回A液繼續(xù)誘導(dǎo)，A液和B液交替誘導(dǎo)3～4次(8～10 d)。誘導(dǎo)結(jié)束后，吸走六孔板中的成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基，用PBS洗1～2次，每孔加入2 ml 4%多聚甲醛溶液固定30 min，吸棄甲醛溶液，每孔加入1 ml配好的油紅O染液染色30 min，顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

1.3.5脂肪干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)及鑒定 胰酶消化P2代PKH26標(biāo)記和未標(biāo)記的ADSCs,以2×104個/cm2的密度接種于六孔板中，每孔加入2 ml低糖DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，吸棄完全培養(yǎng)液，每孔加入2 ml配好的成骨誘導(dǎo)液(基礎(chǔ)培養(yǎng)基、血清、雙抗、谷氨酰胺、抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉、地塞米松),之后每隔3 d換一次成骨誘導(dǎo)液，直至誘導(dǎo)3周。誘導(dǎo)結(jié)束后，吸走成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，用PBS洗1～2次，每孔加入2 ml 4%多聚甲醛溶液固定30 min，吸棄甲醛溶液，每孔加入1 ml茜素紅染液染色3～5 min，顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

1.3.6脂肪干細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)及鑒定 胰酶消化P2代PKH26標(biāo)記和未標(biāo)記的ADSCs，用配制的預(yù)混液(基礎(chǔ)培養(yǎng)基、地塞米松、抗壞血酸、ITS添加物、丙酮酸鈉、脯氨酸)以5.0×105個/ml的密度進(jìn)行重懸，吸取1 ml細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15 ml的離心管中，800 r/min離心5 min，棄上清液，加入0.5 ml的成軟骨誘導(dǎo)液(預(yù)混液，TGF-β3)，擰松離心管蓋，將其置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，72 h后小心更換誘導(dǎo)液，直至誘導(dǎo)28 d。誘導(dǎo)結(jié)束后，軟骨球經(jīng)4%多聚甲醛固定、脫水、石蠟包埋后切片，染色前先脫蠟和脫水，用阿利新藍(lán)染液，染色30 min，自來水沖洗2 min后水性封片劑封片，顯微鏡下觀察染色效果。

1.3.7CCK8檢測ADSCs的增殖能力 胰酶消化P2代PKH26標(biāo)記和未標(biāo)記的ADSCs，以5×103個/孔的密度接種于96孔板中，每孔加入100 μl培養(yǎng)液，接種后連續(xù)培養(yǎng)6 d，每天在相同時間選擇6個孔(3個標(biāo)記的ADSCs，3個未標(biāo)記的ADSCs)加入10 μl的CCK8液，再在培養(yǎng)箱中孵育3 h，最后用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度(optical density,OD)。以3個孔OD值的平均值為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，繪制出ADSCs的生長曲線。

2 結(jié)果

2.1ADSCs光鏡下的形態(tài)學(xué)觀察倒置相差顯微鏡下觀察原代培養(yǎng)的ADSCs，細(xì)胞在未貼壁時大多呈圓形，折光性強，24 h后基本貼壁，細(xì)胞貼壁呈長梭形、多角形(圖1A)，48 h后，可傳P1代培養(yǎng)，傳代后細(xì)胞仍呈長梭形，輪廓清晰，呈旋渦狀或放射狀排列生長(圖1B)。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時，傳P2代培養(yǎng)，傳代后細(xì)胞排列緊密，呈魚群樣生長(圖1C)。細(xì)胞用PKH26標(biāo)記后形態(tài)無明顯變化，熒光顯微鏡下可見紅色熒光染料呈顆粒狀均勻的分布于ADSCs的細(xì)胞膜上(圖1D)。

2.2ADSCs免疫表型鑒定結(jié)果培養(yǎng)至P2代，流式細(xì)胞儀分析的結(jié)果顯示：95.3%的細(xì)胞CD44陽性，95.0%的細(xì)胞CD105陽性，94.6%的細(xì)胞CD29陽性，而僅有0.2%的細(xì)胞CD34陽性，5.4%的細(xì)胞CD45陽性，0.2%的細(xì)胞CD11b陽性，證實培養(yǎng)的是ADSCs，見圖2。

圖1 原代培養(yǎng)ADSCs的生長情況和PKH26標(biāo)記ADSCs后的形態(tài) ×100A：P0代ADSCs；B：P1代ADSCs；C：P2代ADSCs；D：PKH26標(biāo)記的ADSCs

2.3PKH26標(biāo)記前后ADSCs分化能力情況成脂誘導(dǎo)后的3 d可見細(xì)胞逐漸回縮成多角形，并可見少量的脂滴，誘導(dǎo)8 d后的油紅O染色可見細(xì)胞內(nèi)脂滴呈紅色(藍(lán)色箭頭,圖3A和圖3D)。成骨誘導(dǎo)后3 d，細(xì)胞逐漸變?yōu)殚L梭形，約10 d左右可見少量的鈣結(jié)節(jié)沉積，誘導(dǎo)21 d后可見大量的鈣結(jié)節(jié)，茜素紅染色可見橘紅色的鈣結(jié)節(jié)(黃色箭頭，圖3B和圖3E)。成軟骨誘導(dǎo)72 h后可見細(xì)胞逐漸聚集肉眼可見的小團(tuán)，誘導(dǎo)14 d后細(xì)胞團(tuán)逐漸透明成軟骨形態(tài)，阿利新藍(lán)染色后可見軟骨組織中的內(nèi)酸性粘多糖(紅色箭頭，圖3C和圖3F)。通過對比圖3A和圖3D，圖3B和圖3E，圖3C和圖3F發(fā)現(xiàn)，PKH26對ADSCs的成脂、成骨、成軟骨的分化能力無影響。

2.4ADSCs已標(biāo)記與未標(biāo)記的增殖能力比較CCK8結(jié)果分析顯示，細(xì)胞在第2～4天生長速度最快，處于對數(shù)生長期，之后進(jìn)入平臺期，細(xì)胞生長曲線見圖4。分光光度計測定標(biāo)記前后的細(xì)胞在各時間點的吸光度值見表1，統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，細(xì)胞在標(biāo)記前后各時間點的吸光度值的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖2 P2代ADSCs流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果

表1 PKH26標(biāo)記前后的細(xì)胞在各時間點的OD值

圖3 PKH26標(biāo)記前后ADSCs成脂、成骨、成軟骨誘導(dǎo)分化結(jié)果A、D：PKH26標(biāo)記前后的ADSCs成脂誘導(dǎo)后油紅O染色(藍(lán)色箭頭：紅色脂滴)×100；B、E：PKH26標(biāo)記前后的ADSCs成骨誘導(dǎo)后茜素紅染色(黃色箭頭：橘紅色的鈣結(jié)節(jié))×100；C、F：PKH26標(biāo)記前后的ADSCs成軟骨誘導(dǎo)后的阿利新藍(lán)染色(紅色箭頭：軟骨組織中的內(nèi)酸性粘多糖)×400

圖4 PKH26標(biāo)記和未標(biāo)記的ADSCs生長曲線對照組：未用PKH26標(biāo)記的ADSCs的生長曲線;PKH26組:PKH26標(biāo)記后的ADSCs的生長曲線

3 討論

目前研究比較多的細(xì)胞標(biāo)志物有BrdU、放射性同位素、綠色熒光蛋白以及PKH26[7-8]。其中PKH26作為一種親脂性熒光染料，能夠不可逆地均勻的結(jié)合在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙分子層上，熒光顯微鏡下可見紅色熒光(激發(fā)光波長551 nm)。另外，熒光保留時間長，標(biāo)記細(xì)胞種類廣泛，被標(biāo)記的細(xì)胞在細(xì)胞分裂后，熒光染料也可均勻的分布于兩個子細(xì)胞中，而且標(biāo)記后對細(xì)胞的生物學(xué)功能和增殖活性無影響，已成為研究細(xì)胞的遷移轉(zhuǎn)歸及示蹤的理想標(biāo)志物。本研究從新生SD大鼠腹股溝區(qū)的皮下脂肪分離培養(yǎng)得到ADSCs，經(jīng)流式細(xì)胞儀和成脂、成骨、成軟骨鑒定了ADSCs的免疫表型和多向分化的能力，結(jié)果均符合ADSCs的生物學(xué)特征[9-10]。用PKH26成功標(biāo)記ADSCs后，光鏡下的結(jié)果顯示PKH26熒光素染料標(biāo)記的ADSCs與未標(biāo)記的ADSCs在形態(tài)上無明顯差異。在標(biāo)記24 h后熒光顯微鏡下也可觀察到ADSCs細(xì)胞膜上均勻分布的強紅色熒光。將PKH26標(biāo)記的ADSCs進(jìn)行成脂、成骨、成軟骨誘導(dǎo)后發(fā)現(xiàn)PKH26并不影響ADSCs的多向分化能力，CCK8檢測結(jié)果顯示PKH26標(biāo)記后對ADSCs的增殖活性無明顯影響。

近幾年大量文獻(xiàn)報道了關(guān)于PKH26標(biāo)記細(xì)胞后示蹤其在體內(nèi)遷移轉(zhuǎn)歸的研究。例如，Garikipati et al[11]通過將PKH26標(biāo)記的間充質(zhì)干細(xì)胞植入大鼠心肌梗死模型中，用于示蹤間充質(zhì)干細(xì)胞移植后在梗死區(qū)域的停留率。同樣的， Tang et al[12]也通過將PKH26標(biāo)記的心臟干細(xì)胞移植于老鼠心肌梗死模型中，用于研究血管內(nèi)皮生長因子對移植的心臟干細(xì)胞的影響。另外，Huang et al[13]將PKH26標(biāo)記的ADSCs注入大腦中動脈梗塞的老鼠體內(nèi)，研究ADSCs在移植后的體內(nèi)分布情況。國內(nèi)學(xué)者薛改 等[14]通過PKH26標(biāo)記人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，觀察人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植在肝硬化大鼠體內(nèi)后的遷移情況，通過對PKH26標(biāo)記的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)每次傳代后細(xì)胞熒光會逐漸衰減，但體外標(biāo)記一次熒光可維持至20 d左右。這為干細(xì)胞的體內(nèi)示蹤研究提供了依據(jù)，研究者可通過活體熒光機追蹤或者熒光顯微鏡下觀察熒光信號的分布，再結(jié)合相應(yīng)的組織免疫熒光進(jìn)行進(jìn)一步分析。