方廷兵 嚴(yán)浩 徐志蓉 馮梅 王增智

血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)作為新生血管、血管通透性密切關(guān)聯(lián)的血管生成因子,可通過產(chǎn)生一些列的病變(新生血管、纖維組織增生、出血)影響或者破壞眼內(nèi)結(jié)構(gòu)、功能, 從而產(chǎn)生角膜病、糖尿病性視網(wǎng)膜病變等, 降低患者視力, 甚至引起失明。其中, 角膜病是常見的致盲疾病, 目前臨床對于該病的治療, 有靶向生物制劑、角膜移植等, 角膜移植常伴隨不同程度的免疫排斥反應(yīng), 由于手術(shù)、炎癥等內(nèi)外界因素可刺激患者角膜血管和淋巴管生成, 破壞前房免疫屏障, 從而對角膜植片產(chǎn)生免疫排斥［1］。VEGF-C拮抗劑可有效抑制角膜新生血管的生成,從而降低排斥反應(yīng)程度, 提高角膜移植成功率。本次實(shí)驗(yàn)將以大鼠為模型, 進(jìn)一步驗(yàn)證VEGF-C拮抗劑(貝伐單抗)對大鼠角膜新生血管的抑制效果, 以及對角膜移植物成功的影響, 為其臨床的應(yīng)用提供指導(dǎo)。報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 健康SPF級Wistar、SD大鼠各48只, 體質(zhì)量為180～220 g, 雌雄各半, 均購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司,生產(chǎn)許可證SCXK(滬)2015-0018。所有實(shí)驗(yàn)操作遵守動物倫理委員會發(fā)布的倫理及管理指南。實(shí)驗(yàn)前使用裂隙燈檢查大鼠雙眼, 排除新生血管、角膜瘢痕等疾病。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 異種角膜移植 以SD大鼠為角膜供體, Wistar大鼠為角膜受體, 對大鼠角膜右眼行穿透性移植, 具體操作：①散瞳：大鼠置于避光環(huán)境中, 并于術(shù)前約20 min采用復(fù)方托吡卡胺滴眼液點(diǎn)術(shù)眼3次, 以散開瞳孔。②麻醉消毒：腹膜內(nèi)注射戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉, 安爾碘消毒術(shù)眼周圍皮膚及毛發(fā),并用生理鹽水沖洗大鼠結(jié)膜囊。③穿透性角膜移植術(shù)：在40倍放大的顯微鏡視野下選擇直徑3.5 mm的環(huán)鉆, 以便角膜中央形成印跡, 用1 ml注射器針頭適宜角度穿透角膜, 并注入玻璃酸鈉, 然后沿環(huán)鉆印跡剪下角膜植片, 置于0.9%生理鹽水中。然后在Wistar大鼠角膜中制備植床, 使用尼龍線間斷縫合約10針以固定植床與角膜植片, 手術(shù)期間注射玻璃酸鈉, 術(shù)后吸除前房用于維持前房深度玻璃酸鈉, 并注射無菌空氣形成前房, 涂上氧氟沙星軟膏, 縫合眼瞼, 24 h后拆除眼瞼邊緣縫線。術(shù)后30 d內(nèi)定期用妥布霉素滴眼液進(jìn)行抗感染, 4次/d, 1滴/次。

1.2.2 動物給藥 Wistar大鼠隨機(jī)分為低劑量組(給予貝伐單抗5 mg /kg)、中劑量組(給予貝伐單抗10 mg /kg)、高劑量組(給予貝伐單抗15 mg /kg)和對照組(于尾靜脈注射等體積生理鹽水), 每組12只。異種角膜移植成功后, 術(shù)后每周尾靜脈近似體積注射給藥1次后, 連續(xù)給藥4周, 于第28天觀察VEGF-C的表達(dá)量, 角膜新生血管最長長度、新生血管面積, 并統(tǒng)計(jì)角膜移植物成功率。采用酶聯(lián)免疫吸附法測定VEGF-C的表達(dá)量。

1.3 觀察指標(biāo)及判定標(biāo)準(zhǔn) 比較四組大鼠角膜新生血管面積、角膜新生血管最長長度、VEGF-C平均光密度值及角膜移植物成功率。其中角膜移植物效果參照Larkin法對各組角膜植片進(jìn)行評估, 即分別對角膜不透明度、角膜水腫、角膜新血管形成情況進(jìn)行評分, 若三個(gè)指標(biāo)總評分＞5分, 則表明發(fā)生了角膜移植排斥反應(yīng), 移植失敗。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示, 采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率(%)表示, 采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組角膜新生血管最長長度、新生血管面積比較低劑量組、中劑量組、高劑量組角膜新生血管最長長度、新生血管面積均低于對照組, 且高劑量組新生血管面積為(8.63±0.74)mm2, 顯著低于低劑量組的(12.15±1.37)mm2, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

2.2 四組VEGF-C平均光密度值及移植成功率比較 低劑量組、中劑量組、高劑量組VEGF-C平均光密度值均顯著低于對照組, 且高劑量組的VEGF-C平均光密度值顯著低于低劑量組, 高劑量組、中劑量組移植成功率顯著高于對照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

表1 四組角膜新生血管最長長度、新生血管面積比較( ±s)

表1 四組角膜新生血管最長長度、新生血管面積比較( ±s)

注：與對照組比較, aP＜0.05；與高劑量組比較, bP＜0.05

低劑量組 12 1.43±0.24ab 12.15±1.37ab中劑量組 12 1.02±0.19a 9.83±0.96a高劑量組 12 0.83±0.14a 8.63±0.74a對照組 12 2.12±0.26 15.35±1.42

表2 四組VEGF-C平均光密度值及移植成功率比較［ ±s, %(只)］

表2 四組VEGF-C平均光密度值及移植成功率比較［ ±s, %(只)］

注：與對照組比較, aP＜0.05；與高劑量組比較, bP＜0.05

低劑量組 12 25.43±8.04ab 66.67(8)中劑量組 12 21.02±7.59a 83.33(10)a高劑量組 12 17.83±7.14a 91.67(11)a對照組 12 35.12±9.26 50.00(6)

3 討論

眼球作為新生血管性疾病高發(fā)器官, 為保證眼球屈光系統(tǒng)的透明性, 正常的角膜不存在血管系統(tǒng)［2-5］。角膜的病變或者其他原因刺激角膜血管的形成, 導(dǎo)致角膜透明性、視力降低, 甚至引起患者失明。血管內(nèi)皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子等各種生長因子在誘導(dǎo)新生血管過程中起重要作用, 其中血管內(nèi)皮生長因子作用更為顯著, 主要通過促進(jìn)血管內(nèi)皮有絲分裂而誘導(dǎo)血管新生［6-10］。目前,以靶向生物制劑為主的血管內(nèi)皮生長因子拮抗劑在治療血管新生、血管通透性增加為主的眼內(nèi)疾病中逐漸顯現(xiàn)出獨(dú)特的療效優(yōu)勢, 而且還能有效降低角膜移植排斥反應(yīng), 促進(jìn)患者預(yù)后, 提高手術(shù)成功率和視力。

本次研究顯示, 低劑量組、中劑量組、高劑量組角膜新生血管最長長度、新生血管面積均低于對照組, 且高劑量組新生血管面積顯著低于低劑量組, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。低劑量組、中劑量組、高劑量組VEGF-C平均光密度值均顯著低于對照組, 且高劑量組的VEGF-C平均光密度值顯著低于低劑量組, 高劑量組、中劑量組移植成功率顯著高于對照組, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。表明VEGF-C拮抗劑可有效抑制VEGF-C的表達(dá)、大鼠角膜新生血管, 阻礙大鼠角膜新生血管的生長, 且隨著VEGF-C拮抗劑劑量的增加, 抑制效率呈現(xiàn)一定程度的增加趨勢, 從而降低新生血管對角膜的侵襲和角膜移植排斥反應(yīng), 提高移植成功率。

綜上所述, VEGF-C拮抗劑對大鼠角膜新生血管的抑制效果顯著, 可有效降低降低角膜移植排斥反應(yīng), 提高移植成功率。