杜瑞煥 高素艷 張 誼 姚彥坡

(農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)站；唐山市畜牧水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測中心，唐山 063000)

黃曲霉毒素是一類由黃曲霉 (A.Flavus) 和寄生曲霉 (A.Parasiticus)產(chǎn)生的強(qiáng)致癌、劇毒性真菌毒素，包括B、G和M族，其中B1最普遍且毒性最強(qiáng)，為氰化鉀的10倍、砒霜的68倍，致癌力為六六六農(nóng)藥的10 000倍，人或動(dòng)物食用受毒素污染的農(nóng)產(chǎn)品和食品后會導(dǎo)致機(jī)體病變甚至死亡，嚴(yán)重威脅消費(fèi)者健康與生命安全[1]。黃曲霉毒素主要污染花生、玉米等農(nóng)產(chǎn)品，給我國農(nóng)產(chǎn)品和食品安全帶來嚴(yán)重威脅[1-2]。因此，消除花生等農(nóng)產(chǎn)品中黃曲霉毒素污染，減輕其對人畜的不良影響，降低其代謝產(chǎn)物在農(nóng)產(chǎn)品及畜禽產(chǎn)品中的殘留，保證農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全，是當(dāng)前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)研究的熱點(diǎn)之一[3-6]。

花生黃曲霉毒素污染的防控重在源頭治理，目前，防控花生等農(nóng)產(chǎn)品中黃曲霉菌侵染及毒素污染過程中以化學(xué)防治為主。由于化學(xué)防治成本較高和易污染環(huán)境，而且產(chǎn)毒黃曲霉易對殺菌劑產(chǎn)生抗藥性，所以，尋找一種對人畜健康、對環(huán)境友好的控制措施勢在必行[7-8]?；ㄉv果內(nèi)拮抗細(xì)菌分布廣、種類多、數(shù)量大，在長期進(jìn)化過程中，與作物建立了密切關(guān)系，其中有些細(xì)菌具有抑制病原菌、促進(jìn)植物生長、增強(qiáng)植株抗逆性、增殖和擴(kuò)散快等優(yōu)點(diǎn)，因而成為發(fā)展前景很好的病原微生物生防菌[8]。本文以產(chǎn)毒黃曲霉及毒素為研究對象，從花生中分離有益微生物，并采用活體方法篩選拮抗細(xì)菌，研究拮抗菌的抗菌活性，以期探索解決花生黃曲霉毒素污染的防控瓶頸問題途徑。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

產(chǎn)毒黃曲霉由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所質(zhì)標(biāo)室/農(nóng)業(yè)部生物毒素檢測重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。有益微生物從采自河北省灤南、灤縣、遷西、遷安、玉田及豐南等主產(chǎn)區(qū)縣的健康花生莢果中分離獲得。

1.2 花生中細(xì)菌的分離、純化與保存

花生中細(xì)菌的分離參照Dey等[7]的方法。選取上述區(qū)縣主產(chǎn)區(qū)的花生莢果，帶回實(shí)驗(yàn)室分離。在超凈工作臺中將花生莢果用1%次氯酸鈉溶液浸泡10 min，再用無菌水沖洗5次，瀝干水分。用研缽研碎后放置于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板中，于28℃恒溫培養(yǎng)，每天觀察菌落生長狀況，并及時(shí)挑取特征差異明顯、分離良好的單菌落，進(jìn)一步純化獲得純菌株，在牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基上保藏備用。

1.3 產(chǎn)毒黃曲霉拮抗細(xì)菌的離體篩選

采用對峙培養(yǎng)法對黃曲霉拮抗細(xì)菌進(jìn)行篩選。將預(yù)先準(zhǔn)備好的黃曲霉菌菌碟置于PDA平板中央，然后用高溫滅菌的牙簽蘸取內(nèi)生細(xì)菌，等距離(距病原菌2 cm處)對稱點(diǎn)接到PDA平板上，于28 ℃黑暗培養(yǎng)，3～7 d觀察抑菌帶的有無及大小，重復(fù)3次。選出抑菌帶大于5 mm的內(nèi)生細(xì)菌菌株在花生仔仁上進(jìn)行復(fù)篩及計(jì)算抑制率。抑制率=(對照生長量-處理生長量)/對照生長量×100%。

1.4 產(chǎn)毒黃曲霉拮抗細(xì)菌的活體篩選

1.4.1 拮抗菌發(fā)酵液的準(zhǔn)備：用挑針挑取離體實(shí)驗(yàn)中具有抑菌活性的拮抗細(xì)菌菌株的單菌落，轉(zhuǎn)移至裝有50 mL NB培養(yǎng)液的三角瓶中，于28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)1 d。吸1 mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至裝有50 mL NB培養(yǎng)液的三角瓶中，28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)2 d，獲得拮抗菌株的發(fā)酵液。

1.4.2 拮抗細(xì)菌的活體篩選：把發(fā)酵2 d的拮抗菌發(fā)酵液(孢子最終濃度為3.0×106孢子/mL)和培養(yǎng)7 d生長旺盛的黃曲霉菌菌懸液(孢子最終濃度為3.0×106孢子/mL-1)分別浸泡花生莢果30 min，陰涼處被干后放入無菌平板，每板20?；ㄉ腥?，放入光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 d。培養(yǎng)箱培養(yǎng)條件為：溫度28 ℃，濕度70%～80 %，光照為12 h黑暗，12 h光照。以不浸菌液為空白對照，每處理設(shè)3次重復(fù)。

1.5 拮抗菌B65-2對產(chǎn)毒黃曲霉的抑制作用

1.5.1 上清液和過濾液制備：生防菌B65-2在LB斜面上活化后，取一環(huán)于LB培養(yǎng)液中，100 mL/300 mL裝液量，37 ℃，160 r/min振蕩培養(yǎng)48 h后，制備成以下處理液：上清液：培養(yǎng)液在120 00 r/min下離心15 min，取上清，用0.22 μm細(xì)菌過濾器過濾后得到無菌的過濾液。

1.5.2 菌懸液制備：培養(yǎng)液在12 000 r/min下離心15 min，棄上清，菌體用無菌水清洗3次再離心，加入無菌水。

1.5.3 蛋白粗提液：培養(yǎng)液于4 ℃下12 000 r/min離心15 min棄沉淀，在上清液中加固體硫酸銨至70%飽和度，4 ℃靜置過夜，于4 ℃下10 000 r/min離心20 min，棄上清液，沉淀用1/25體積10 mmol/L，pH7.0磷酸緩沖液懸浮，然后用0.22 μm細(xì)菌過濾器過濾可能存在的細(xì)菌。

1.5.4 生防菌代謝產(chǎn)物對黃曲霉孢子萌發(fā)的影響：產(chǎn)毒黃曲霉的孢子濃度調(diào)整為1×106個(gè)/mL，與終濃度為1×107個(gè)/mL的拮抗菌混合培養(yǎng)于 PD 液體培養(yǎng)基中(以不加拮抗菌為對照)，置于28 ℃搖床培養(yǎng)。分別于培養(yǎng) 8、16、24 h 后顯微鏡觀察黃曲霉孢子萌發(fā)情況。每個(gè)處理隨機(jī)觀察 200 個(gè)黃曲霉孢子，計(jì)算孢子萌發(fā)率。實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次。

1.5.5 拮抗菌抑制黃曲霉菌絲生長及黃曲霉毒素產(chǎn)生的研究：用上述制備好的上清液、過濾液及蛋白粗提液培養(yǎng)黃曲霉，以測定其對黃曲霉生長和產(chǎn)毒的影響，28 ℃ 霉菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 d 后，培養(yǎng)液經(jīng) Beacon 黃曲霉毒素固相萃取柱純化后，用 LC-MS / MS 檢測黃曲霉毒素含量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次；用無菌打孔器打直徑6 mm 的長有黃曲霉的瓊脂塊，倒置于 PDA 培養(yǎng)基平板中央，在等距離處分別放置4 個(gè)直徑6 mm 的無菌濾紙片。取10 μL 細(xì)菌培養(yǎng)液(37 ℃營養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)過夜，調(diào)整濃度為1×107個(gè)/mL)滴加到每張濾紙片上，對照加空白培養(yǎng)基，28 ℃恒溫培養(yǎng)2 d，每株細(xì)菌重復(fù)3次；液相色譜條件：ZORBAX Eclipse Plus C18，1.8 μm，3. 0×100 mm；柱溫 40 ℃；流動(dòng)相：A：甲酸水(含0.1%甲酸)，B：乙腈，梯度洗脫，流速0. 4 mL/ min，進(jìn)樣量20 μL，質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，多重反應(yīng)監(jiān)測，GAS Temp：350 ℃，GAS Flow：10 L/ min；Nebulizer：40 psi。

1.5.6 拮抗菌對黃曲霉毒素的分解作用：選取復(fù)篩拮抗菌菌株接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中發(fā)酵 24 h，取 5 mL 菌體發(fā)酵液加入4種黃曲霉毒素的混合標(biāo)準(zhǔn)品至終濃度為 20 μg / L，以空白培養(yǎng)基加入黃曲霉毒素作為空白對照，置于 37 ℃ 培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別于 2、4、6 d 取樣，檢測 4 種黃曲霉毒素的含量，3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.6 拮抗菌株B65-2的鑒定

1.6.1 常規(guī)鑒定方法參見文獻(xiàn)[7]。

1.6.2 16S rDNA PCR擴(kuò)增及序列測定: B65-2基因組DNA的提取采取試劑盒的方法。以27 F(5′- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′)為引物擴(kuò)增細(xì)菌菌株的16S rDNA。PCR體系：10×PCR緩沖液5 μL，dNTPs (10 mmol) 1 μL，引物27 f (10 μmol/L-1) 1 μL，引物R1492 (10 μmol/L-1) 1 μL，模板DNA約10 pmol，Taq酶 (5 μ/μL-1) 0.25 uL，加重蒸水至50 μL。擴(kuò)增條件：98 ℃ 5 min；95 ℃ 35 s，55 ℃ 35 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 8 min。瓊脂糖凝膠電泳并回收目標(biāo)DNA片段，由上海派諾森生物科技公司進(jìn)行測序；測序結(jié)果用BLAST軟件在GenBank進(jìn)行同源性比較，以ClustalX進(jìn)行多序列比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生中微生物的分離

根據(jù)菌落形態(tài)、顏色及出現(xiàn)早晚的差異，從表面徹底消毒的花生莢果碾碎液涂布的平板中挑取不同菌落進(jìn)行純化，得到988株細(xì)菌，其中，灤南花生莢果中分離細(xì)菌菌株208株，灤縣花生莢果分離出162株，遷西花生莢果分離出182株，遷安花生莢果分離出211株，玉田和豐南獲得花生莢果225株。結(jié)果顯示，不同產(chǎn)區(qū)花生仔仁中的細(xì)菌數(shù)量明顯不同。

2.2 內(nèi)生拮抗細(xì)菌的篩選

2.2.1 離體拮抗篩選

將花生仔仁中分離獲得的988株細(xì)菌通過對峙培養(yǎng)法進(jìn)行拮抗篩選，對產(chǎn)毒黃曲霉拮抗效果在50%以上的10株菌進(jìn)行下一步的研究(表1)。其中菌株B25-5對產(chǎn)毒黃曲霉的抑制率可達(dá)95.5%，其次為菌株B38-2和B22-1，抑制率分別達(dá)到83%和79.5%，拮抗效果顯著。

表1 生防菌株對黃曲霉菌的拮抗作用

2.2.2 活體拮抗篩選

將上述離體條件下具有較強(qiáng)拮抗作用的細(xì)菌在花生仔仁上進(jìn)行抑黃曲霉毒素篩選(表2)，結(jié)果表明獲得的拮抗細(xì)菌在花生仔仁上表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑毒效果。其中，菌株B25-5抑毒率可達(dá)92%，其次為B19-3的84.5%及B38-2的78.5%，對菌株B25-5抑黃曲霉菌毒素的效果進(jìn)一步進(jìn)行研究。

表2 生防菌對黃曲霉毒素的抑制效果

2.3 菌株B25-5代謝物對黃曲霉菌的影響

利用已制備的培養(yǎng)液、上清液、濾液及蛋白粗提液對黃曲菌絲生長的影響進(jìn)行研究，菌株B25-5培養(yǎng)液對黃曲霉菌菌絲生長的抑制作用可達(dá)95.5%，生防菌的上清液抑菌率達(dá)到70%以上，濾液達(dá)到65%以上，蛋白粗提液的抑制作用效果較低，為57.6%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，菌株B25-5及活性物質(zhì)對黃曲霉菌具有較強(qiáng)的抑制作用，且在-4 ℃的低溫條件下具有顯著的拮抗活性(表3)。

表3 菌株B25-5及活性物質(zhì)對黃曲霉菌生長的抑制作用

2.4 菌株B25-5對黃曲霉孢子萌發(fā)及黃曲霉毒素產(chǎn)生的抑制作用

菌株B25-5對黃曲霉菌孢子萌發(fā)具有顯著的抑制作用，黃曲霉與拮抗菌混合培養(yǎng) 24 h 后黃曲霉孢子的萌發(fā)率顯著降低(P<0. 01)，黃曲霉孢子的萌發(fā)率由 96.5 % 下降至 4.2 %(表4)；黃曲霉與拮抗菌混合培養(yǎng)后，LC/MS/MS檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素的產(chǎn)生量急劇下降，72h后4 種黃曲霉毒素未檢出(表5)。

表4 菌株B25-5對黃曲霉孢子萌發(fā)的抑制效果

表5 菌株B25-5對黃曲霉毒素的抑制效果(%)

2.5 菌株B25-5對黃曲霉毒素的降解作用

利用 LC/ MS/ MS技術(shù)檢測黃曲霉毒素濃度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，拮抗菌B25-5具有顯著降解黃曲霉毒素的作用，隨著時(shí)間的增加，對黃曲霉毒素的降解率逐漸升高，到第6天時(shí)，菌株B25-5對黃曲霉毒素的降解率可達(dá) 92.5%。黃曲霉毒素 G1 和 G2 在菌株B25-5培養(yǎng)第 4天時(shí)未檢出，拮抗菌降解黃曲霉毒素 G1、G2 的速度顯著高于降解黃曲霉毒素 B1、B2的速度(表6)。

表6 菌株B25-5對黃曲霉毒素的降解作用/μg/mL

2.6 黃曲霉拮抗菌株B25-5的鑒定

2.6.1 常規(guī)鑒定

形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，菌株B25-5在NA培養(yǎng)基上菌落圓形，邊緣不規(guī)則，表面較光滑，不產(chǎn)色素；菌體桿狀，大小為(0.9～1.2) μm×(2.8～3.2) μm；革蘭氏染色陽性；產(chǎn)芽孢，芽孢橢圓形；具有運(yùn)動(dòng)性，證明該菌株為芽孢桿菌(Bacillussp.)。

菌株生理生化測定結(jié)果見表7。菌株B25-5接觸酶反應(yīng)、葡萄糖、甘油、D-木糖、淀粉水解、山梨醇、甘露糖、果糖、肌醇及纖維二糖均為陽性，氧化酶、D-阿拉伯糖等試驗(yàn)均為陰性，參照文獻(xiàn)中細(xì)菌鑒定方法[8,9]，該菌株符合芽孢桿菌(Bacillussp.)的基本理化特性，與解淀粉芽孢桿菌有極高的相似性。

表7 菌株B25-5的生理生化特征

注：“+”為陽性反應(yīng)；“-”為陰性反應(yīng)。

2.6.2 16S rDNA的序列分析

以菌株B25-5基因組DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增得到該菌株的16S rDNA。測序結(jié)果表明該菌株16S rDNA序列長度為1477 bp。BLAST分析發(fā)現(xiàn)該菌株的16S rDNA序列與芽孢桿菌屬細(xì)菌的16S rDNA相似，調(diào)出其中已鑒定菌株的16S rDNA，用Clustal W進(jìn)行多重序列對比，菌株B25-5與解淀粉芽孢桿菌菌株JF496388同源性達(dá)98%。結(jié)合菌株B25-5形態(tài)特征及理化指標(biāo)測定等鑒定結(jié)果，初步將菌株B25-5鑒定為解淀粉芽孢桿菌。

3 討論與結(jié)論

黃曲霉毒素是已知的毒性、致癌性最強(qiáng)的一類天然生物毒素，被世界衛(wèi)生組織認(rèn)定為Ⅰ類致癌物[10-13]。黃曲霉毒素具有穩(wěn)定的理化性質(zhì)，耐高溫，難以用一般的加工處理方法去除，人或畜禽食用受黃曲霉毒素污染的農(nóng)產(chǎn)品可導(dǎo)致機(jī)體病變，甚至死亡。治理農(nóng)產(chǎn)品中黃曲霉毒素的最佳辦法就是預(yù)防[14，15]，應(yīng)用微生物或其代謝產(chǎn)物來抑制黃曲霉毒素產(chǎn)生或脫毒的生物防治技術(shù)，由于對人體無害、對環(huán)境友好，成為近年來真菌毒素防治研究的熱點(diǎn)。利用生物技術(shù)體系來防控黃曲霉毒素污染的成功案例國外早有報(bào)道，由于種種原因，我國相關(guān)的研究起步較晚，能夠有效做為防控黃曲霉毒素污染技術(shù)手段的微生物制劑亟待開發(fā)。

本研究針對花生中黃曲霉毒素污染防控難題，采用生物防治技術(shù)，以期為我國花生黃曲霉毒素污染治理探索一條有效途徑。本研究從唐山市各種植區(qū)收獲的花生莢果中分離獲得微生物菌株988多株，其中菌株B25-5對黃曲霉生長的控制效果達(dá)90%以上，效果顯著，具有極大的開發(fā)應(yīng)用潛力。在抑制黃曲霉菌生長的實(shí)驗(yàn)中，拮抗菌株B25-5和黃曲霉混合培養(yǎng)24 h后，黃曲霉幾乎被完全抑制，培養(yǎng)液對黃曲霉菌菌絲生長的抑制作用可達(dá)95.5%，上清液和過濾液對黃曲霉也具有良好的控制效果，因此拮抗菌株B25-5代謝產(chǎn)物應(yīng)該是抑制黃曲霉菌絲生長的主要機(jī)制。實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)拮抗菌B25-5與黃曲霉孢子混合培養(yǎng)時(shí)能顯著抑制黃曲霉孢子的萌發(fā)，使用B25-5發(fā)酵液與黃曲霉孢子混合培養(yǎng)時(shí)，孢子萌發(fā)速度顯著小于空白對照，幾乎不產(chǎn)生黃曲霉毒素，證明拮抗菌發(fā)酵液能夠顯著抑制孢子萌發(fā)，且能夠降低毒素的產(chǎn)生。拮抗菌生長過程中產(chǎn)生的某些胞外抑菌活性物質(zhì)，能夠顯著的干擾黃曲霉孢子的萌發(fā)，抑制黃曲霉菌絲的生長和黃曲霉毒素的產(chǎn)生。關(guān)于拮抗微生物對黃曲霉毒素的降解研究，國內(nèi)學(xué)者孔青等報(bào)道的海洋巨大芽胞桿菌對黃曲霉毒素合成的抑制率為50.75%[16]，Abbas等[17]的研究結(jié)果顯示，他們獲得的不產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉菌株能夠顯著的控制產(chǎn)毒菌株，能夠降低 65%～94%的黃曲霉毒素產(chǎn)生。本研究中獲得的拮抗菌株B25-5對黃曲霉毒素B1的降解率可達(dá) 90%以上，對G1和G2可在第4天時(shí)可全部降解，證明菌株B25-5具有極強(qiáng)的解毒能力，應(yīng)用前景廣闊。本研究表明，內(nèi)生拮抗細(xì)菌B25-5可通過分泌抗菌物質(zhì)，來抑制黃曲霉菌絲生長和分生孢子萌發(fā)，抑制和減輕黃曲霉菌侵染和毒素污染的發(fā)生，即菌株分泌的抗菌物質(zhì)為菌株抑菌抑毒機(jī)制之一。但其解毒機(jī)制、對環(huán)境中微生物種類和區(qū)系影響、對花生等農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)是否影響有待進(jìn)一步深入探索和研究。