程 銘 焦文佳 陶 冶 夏廉臣 王雪暉 王春維,2

(武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院1，武漢 430023) (國家糧食局糧油資源綜合開發(fā)工程技術(shù)研究中心2，武漢 430023)

植物甾醇和膽固醇同屬甾醇類，都是以環(huán)戊烷全氫菲為骨架的一種醇類化合物，在結(jié)構(gòu)上極其相似，植物甾醇與膽固醇的不同之處在于其支鏈上的雙鍵和甲基[1]。植物甾醇較膽固醇支鏈更長，有更強(qiáng)的疏水性[2]，可降低人體對(duì)膽固醇的吸收。膽固醇是脂質(zhì)體等藥物輸送體系的重要組成部分，可嵌入磷脂雙分子層，調(diào)節(jié)磷脂膜的穩(wěn)定性。隨著現(xiàn)代人健康生活意識(shí)的不斷提高，膽固醇的應(yīng)用對(duì)于一些高血脂人群受到限制，為此學(xué)界開始植物甾醇取代膽固醇制備脂質(zhì)體的研究。Marie等[3]發(fā)現(xiàn)植物甾醇可以降低大豆磷脂膜的通透性；楊貝貝[4]的研究也表明混合植物甾醇對(duì)脂質(zhì)體形成、膜的穩(wěn)定性、包埋力作用比膽固醇要大。且植物甾醇在人體內(nèi)吸收率較低[5]，過量攝入也不會(huì)對(duì)人體造成危害，已被證實(shí)是一種綠色安全的降膽固醇藥物，其取代膽固醇制備脂質(zhì)體是國內(nèi)外研究熱點(diǎn)。

脂質(zhì)體是由磷脂分散在水中形成的封閉囊泡結(jié)構(gòu)，是優(yōu)良的藥物運(yùn)輸載體，可用于包埋親水性和疏水性活性成分，具有靶向、緩釋、降低毒性和提高藥物穩(wěn)定性等作用。但其自身穩(wěn)定性易受外界環(huán)境如pH、溫度、離子強(qiáng)度等影響。殼聚糖是一種天然的高分子生物材料，其在酸性溶液中呈現(xiàn)陽離子性質(zhì)，可通過靜電相互作用與帶負(fù)電的脂質(zhì)體結(jié)合，在脂質(zhì)體表面形成一層保護(hù)膜；此外疏水相互作用、氫鍵、范德華力等多種相互作用力的存在使殼聚糖修飾脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)變得更加豐富而復(fù)雜[6]。劉瑋琳等[7]發(fā)現(xiàn)以殼聚糖修飾的脂質(zhì)體比未修飾的脂質(zhì)體穩(wěn)定，且高濃度殼聚糖修飾脂質(zhì)體穩(wěn)定性更好。帥武平等[8]考察了不同相對(duì)分子量的殼聚糖對(duì)脂質(zhì)體性質(zhì)的影響，得到較高相對(duì)分子質(zhì)量殼聚糖修飾的脂質(zhì)體具有更好的穩(wěn)定性和抗血清能力，同時(shí)其細(xì)胞毒性要小于陽離子脂質(zhì)體。嚴(yán)佳蕾等[9]研究了不同濃度殼聚糖修飾脂質(zhì)體對(duì)包載姜黃素的效果，發(fā)現(xiàn)0.4%的殼聚糖對(duì)姜黃素脂質(zhì)體保護(hù)效果最佳。

殼聚糖修飾脂質(zhì)體對(duì)于提高體系穩(wěn)定性，降低藥物的泄漏率具有重要意義，但目前對(duì)植物甾醇脂質(zhì)體的研究較少，殼聚糖修飾植物甾醇脂質(zhì)體的研究也鮮見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過乙醇注入法制備植物甾醇脂質(zhì)體，并以不同濃度殼聚糖對(duì)其進(jìn)行修飾、優(yōu)化配比，考察了pH、溫度、離子強(qiáng)度等對(duì)CS-PLs穩(wěn)定性的影響，并通過模擬人體胃腸環(huán)境探究了脂質(zhì)體的消化穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物甾醇(>95%)：武漢遠(yuǎn)成共創(chuàng)科技有限公司；大豆卵磷脂(70%)、殼聚糖(脫乙酰度≥95%)：aladdin試劑公司；胃蛋白酶、胰酶：Sigma-Aldrich公司；無水乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、膽鹽等試劑均為分析純：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；T18高速分散機(jī)：IKA公司；R-3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士Buchi公司；pH計(jì)：上海奧豪斯儀器有限公司；Nano-ZS粒度儀：英國Malvern公司；Turbiscan Lab穩(wěn)定性分析儀：法國Formulaction公司；JEM-2100透射電鏡：日本電子株式會(huì)社。

1.3 方法

1.3.1 CS-PLs的制備

采用乙醇注入法[10]制備PLs，將大豆卵磷脂與植物甾醇按4∶1的比例溶于無水乙醇中，使磷脂濃度為40 mg/mL，超聲溶解。在高速分散(10 000r/min)條件下，按有機(jī)相與水相比例為1∶5，將卵磷脂植物甾醇混合液緩慢注入水中，繼續(xù)分散2 min，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙醇，加水稀釋至原水相含量，得到PLs。

殼聚糖溶液的制備：稱取0.2 g殼聚糖粉末溶于100 mL 1%乙酸水溶液中，40 ℃水浴攪拌溶解，過濾除去不溶物，置于4 ℃冰箱中水化過夜，取出后稀釋備用。

分別將PLs加入等體積不同濃度的殼聚糖溶液中，調(diào)節(jié)pH至3.5，在10 000 r/min下高速分散2 min，得到CS-PLs。

1.3.2 CS-PLs理化性質(zhì)表征

1.3.2.1 粒徑與Zata電位測定

樣品用去離子水稀釋至一定濃度后，采用動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)測定植物甾醇脂質(zhì)體平均粒徑、多分散系數(shù)(Polydispersity index，PdI)和Zeta電位。

1.3.2.2 CS-PLs穩(wěn)定性分析

采用多重光散射技術(shù)(掃描波長880 nm)，分析不同環(huán)境下脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。將制備好的樣品振蕩搖勻，倒入樣品池中，測定脂質(zhì)體的穩(wěn)定性指數(shù)TSI(Turbiscan Stability Index)。測試樣品加入量為15～20 mL，測定溫度為25 ℃，測定時(shí)間為1 h，掃描間隔為25 s。

1.3.2.3 CS-PLs形態(tài)觀察

取制備好的CS-PLs樣品1 mL，用去離子水稀釋至磷脂質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL，滴至專用銅網(wǎng)上，濾紙吸干多余脂質(zhì)體；用3%磷鎢酸進(jìn)行負(fù)染色，并用濾紙輕輕吸干多余染液，自然揮干，透射電鏡下觀察脂質(zhì)體微觀結(jié)構(gòu)。

1.3.3 CS-PLs體外消化穩(wěn)定性

1.3.3.1 消化液配制

參照Liu等[11]報(bào)道的模擬胃腸消化液的配制方法并加以改進(jìn)。胃液儲(chǔ)備液(Simulated gastric fluid, SGF)的配制：取2 gNaCl溶于800mL去離子水中，用0.1 mol/LHCl調(diào)節(jié)其pH至2.0，定容至1 L，4 ℃儲(chǔ)藏備用。腸液儲(chǔ)備液(Simulated intestinal fluid, SIF)的配制：取6.8 gKH2PO4溶于800 mL去離子水中，用0.1 mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，定容至1 L，4 ℃儲(chǔ)藏備用。胃蛋白酶和胰酶分別用胃腸儲(chǔ)備液溶解，3 000 r/min離心取上清液。

1.3.3.2 體外模擬胃腸消化

胃消化：將10 mL脂質(zhì)體與9 mLSGF混合于50 mL離心管，調(diào)節(jié)pH至2.0，在37 ℃恒溫水浴搖床上，以95 r/min轉(zhuǎn)速平衡10 min，加入1 mL胃蛋白酶(80 mg/mL)，開始消化。

腸消化：將膽鹽溶于SIF(20 mg/mL)中，攪拌溶解。取10 mL脂質(zhì)體與9 mLSIF膽鹽混合液于50 mL調(diào)節(jié)pH至7.0，在37 ℃恒溫水浴搖床上，以95 r/min 轉(zhuǎn)速平衡10 min，然后加入1 mL胰酶(160mg/mL)，開始消化。

分別在15、30、60、120、180 min取樣測定消化后脂質(zhì)體粒徑、電位大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度殼聚糖修飾PLs的制備

以不同濃度的殼聚糖溶液修飾PLs，所得CS-PLs中殼聚糖質(zhì)量濃度分別為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8 mg/mL。如表1所示，當(dāng)pH為3.5時(shí)，低濃度的殼聚糖對(duì)脂質(zhì)體粒徑和PdI影響較??；當(dāng)殼聚糖質(zhì)量濃度達(dá)到0.3 mg/mL以上時(shí)，脂質(zhì)體中會(huì)出現(xiàn)較大顆粒，且多分散性變差。未添加殼聚糖脂質(zhì)體粒徑較小，由于磷脂帶負(fù)電，脂質(zhì)體也呈負(fù)電位。而殼聚糖表面帶正電荷，隨著殼聚糖的加入，殼聚糖吸附在磷脂膜上，使脂質(zhì)體電位由負(fù)轉(zhuǎn)正，且殼聚糖濃度越高，脂質(zhì)體電位越大。當(dāng)殼聚糖質(zhì)量濃度達(dá)到0.3 mg/mL時(shí)，殼聚糖吸附達(dá)到飽和，繼續(xù)提高殼聚糖濃度會(huì)增加脂質(zhì)體修飾層厚度，導(dǎo)致粒徑增加，而電位變化不顯著。因此，選擇0.3 mg/mL殼聚糖為最佳質(zhì)量濃度修飾PLs，分析CS-PLs的穩(wěn)定性影響因素。

表1 不同濃度殼聚糖修飾LPs的平均粒徑、PdI和Zeta電位

由圖1可知，通過激光粒度儀測定乙醇注入法制備的PLs粒徑為70.4 nm，PdI為0.377，粒徑分布范圍廣，并有較多大顆粒存在。經(jīng)0.3 mg/mL殼聚糖修飾后，脂質(zhì)體粒徑雖有所增加，達(dá)到76.73 nm，但PdI降低到0.246，且粒徑分布更集中，大顆粒較少。CS-PLs的透射電鏡測定結(jié)果如圖2所示，脂質(zhì)體呈規(guī)則圓球狀，粒徑為60～70 nm，較激光粒度儀測定結(jié)果偏小，這可能是由于透射電鏡樣品制片時(shí)脫水而引起[12]。

圖1 殼聚糖修飾前后LPs粒徑分布

圖2 CS-PLs透射電鏡圖

2.2 CS-PLs穩(wěn)定性影響因素

電位是評(píng)定脂質(zhì)體穩(wěn)定性的重要指標(biāo)之一，脂質(zhì)體表面所帶電荷越高，顆粒間靜電斥力越大，脂質(zhì)體越穩(wěn)定。除此之外空間位阻、顆粒尺寸和流變性等也常用于評(píng)價(jià)脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。穩(wěn)定性分析儀通過檢測樣品在靜置過程中粒子的遷移，可較真實(shí)地反映脂質(zhì)體的穩(wěn)定性變化；TSI越小，反應(yīng)乳液體系越穩(wěn)定。杭鋒等[13]通過測定不同溫度下超高溫滅菌乳的TSI，構(gòu)建了乳品貨架期加速實(shí)驗(yàn)數(shù)學(xué)模型，并預(yù)測了超高溫滅菌乳的貨架期。黃波等[14]以TSI為指標(biāo)，優(yōu)化了微乳液超聲條件。本實(shí)驗(yàn)以脂質(zhì)體的粒徑、電位為主要指標(biāo)，并通過測定其TSI值，綜合評(píng)價(jià)了脂質(zhì)體在不同環(huán)境下的穩(wěn)定性。

2.2.1 pH對(duì)CS-PLs穩(wěn)定性影響

新鮮制備的PLs，加入殼聚糖后，分別調(diào)節(jié)pH至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，經(jīng)高速分散后，測定CS-PLs穩(wěn)定性。用相應(yīng)pH的去離子水稀釋脂質(zhì)體，測定其粒徑與電位。

圖3 pH對(duì)CS-PLs穩(wěn)定性指數(shù)影響

表2 pH對(duì)CS-PLs穩(wěn)定性影響

pH平均粒徑/nmPdIZeta電位/mV物理穩(wěn)定性2.078.18±1.760.271±0.02143.6±1.27穩(wěn)定3.078.35±0.430.252±0.00560.4±0.44穩(wěn)定4.085.96±1.060.293±0.02257.7±1.76穩(wěn)定5.0133.87±3.780.893±0.02939.9±0.87穩(wěn)定6.03 193.67±419.000.869±0.16323.8±0.50分層7.02 709.63±1 586.830.964±0.06215.2±0.31分層

如表2所示，當(dāng)pH為2～4時(shí)，CS-PLs粒徑均在100 nm以下，并表現(xiàn)出良好的分散性；當(dāng)pH≥5時(shí)，CS-PLs粒徑開始增大，且多分散性也開始變差。由圖3可知，隨著pH增大，CS-PLs穩(wěn)定性反而增強(qiáng)，當(dāng)pH達(dá)到6時(shí)，CS-PLs大量聚集，出現(xiàn)沉淀，其TSI均在10以上。與Sonvico等[15]的研究結(jié)果相似，即當(dāng)pH從2.5增加到5時(shí)，卵磷脂-殼聚糖納米粒的粒徑和電位變化較小，當(dāng)pH大于5時(shí)，納米粒電位顯著下降，且出現(xiàn)聚集。Liu等[16]等以卵磷脂-殼聚糖納米粒包載胰島素，發(fā)現(xiàn)當(dāng)pH由2增加到5.5時(shí)，納米粒粒徑和胰島素包埋率逐漸增加，當(dāng)pH為6時(shí)則出現(xiàn)沉淀。分析其主要原因可能是由于殼聚糖的等電點(diǎn)為6.5左右，當(dāng)pH接近6時(shí)，CS-PLs表面弱的靜電相互作用不足以維持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，顆粒開始聚集，并出現(xiàn)沉淀。

2.2.2 溫度對(duì)CS-PLs穩(wěn)定性影響

新鮮制備的CS-PLs，用穩(wěn)定性分析儀分別在25、30、40、50、60 ℃下測定穩(wěn)定性，每個(gè)樣品掃描時(shí)間為12 h，掃描間隔10 min，取出樣品后測定脂質(zhì)體粒徑與電位。

溫度是影響脂質(zhì)體穩(wěn)定性的重要因素之一。如表3所示，隨著溫度的升高，CS-PLs粒徑逐漸增大，多分散性變差，但其電位、外觀無顯著變化。由圖4可見，在常溫環(huán)境下，CS-PLs的TSI仍在1以下，穩(wěn)定性良好；經(jīng)加熱后，CS-PLs的TSI迅速上升，其主要是由于在加熱條件下，脂質(zhì)體分子運(yùn)動(dòng)更加劇烈，加速了磷脂分子層的水解與氧化，結(jié)構(gòu)破壞[17]。而約2 h后，TSI又呈現(xiàn)緩慢下降趨勢，其可能是殼聚糖充分溶脹，重新自組裝成穩(wěn)定顆粒，提高了CS-PLs穩(wěn)定性。

表3 溫度對(duì)脂質(zhì)體穩(wěn)定性影響

圖4 溫度對(duì)CS-PLs穩(wěn)定性指數(shù)影響

2.2.3 離子強(qiáng)度對(duì)CS-PLs穩(wěn)定性影響

新鮮制備的CS-PLs，分別加入10、25、50、100、150、200 mmol/L的NaCl和CaCl2，調(diào)節(jié)脂質(zhì)體的離子強(qiáng)度，37 ℃水浴攪拌10 min，通過穩(wěn)定分析儀測定脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。并分別用對(duì)應(yīng)濃度的NaCl和CaCl2溶液稀釋脂質(zhì)體，測定其粒徑和電位。

如表4所示，NaCl濃度對(duì)CS-PLs穩(wěn)定性有顯著影響，當(dāng)濃度為10 mmol/L時(shí)，脂質(zhì)體粒徑為87.14 nm，多分散性較好；隨著NaCl濃度的加大，鹽離子的存在會(huì)屏蔽脂質(zhì)體表面電荷，使脂質(zhì)體電位逐漸降低，粒徑顯著增大，穩(wěn)定性變差。曹金娜等[18]也發(fā)現(xiàn)當(dāng)NaCl濃度大于20 mmol/L時(shí)，脂質(zhì)體穩(wěn)定性較差。如圖5所示，穩(wěn)定性分析也表現(xiàn)出相似結(jié)果。

圖5 NaCl濃度對(duì)CS-PLs穩(wěn)定性指數(shù)影響

表4 NaCl濃度對(duì)CS-PLs穩(wěn)定性影響

NaCl濃度/mmol/L平均粒徑/nmPdIZeta電位/mV物理穩(wěn)定性1087.14±0.520.307±0.0341.2±0.98穩(wěn)定25197.55±7.690.578±0.0237.9±1.93分層501 358.67±59.970.608±0.1529.6±0.55分層1001 361.67±245.490.720±0.4924.5±0.78分層1501 241.03±440.110.677±0.0620.2±0.80分層2001 786.24±841.120.964±0.06219.0±0.87分層

對(duì)于陰離子脂質(zhì)體，Ca2+可以在脂質(zhì)體之間形成“鹽橋”，增加磷脂膜疏水性，導(dǎo)致脂質(zhì)體的失穩(wěn)[19]。經(jīng)殼聚糖修飾后，CS-PLs表面帶正電荷，加入Ca2+并未引起脂質(zhì)體的聚集。如表5所示，CS-PLs對(duì)CaCl2表現(xiàn)出較好的耐受性，在200 mmol/LCaCl2的環(huán)境下也能維持穩(wěn)定。鹽離子的存在也會(huì)影響脂質(zhì)體表面電荷，隨著離子強(qiáng)度的增加，脂質(zhì)體電位逐漸降低。如圖6所示，穩(wěn)定性分析顯示，不同離子強(qiáng)度下，CS-PLs的TSI均在1以下，當(dāng)CaCl2濃度為100 mmol/L時(shí)，脂質(zhì)體的TSI最小為0.4，比未添加Ca2+的脂質(zhì)體表現(xiàn)出更好的穩(wěn)定性，其可能原因是由于金屬離子的作用使?；湹呐帕懈泳o密，降低了磷脂膜的流動(dòng)性，從而提高CS-PLs穩(wěn)定性[20]。

圖6 CaCl2濃度對(duì)CS-PLs穩(wěn)定性指數(shù)影響

表5 CaCl2濃度對(duì)脂質(zhì)體穩(wěn)定性影響

CaCl2濃度/mmol/L平均粒徑/nmPdIZeta電位/mV物理穩(wěn)定性10106.83±13.760.373±0.0638.07±2.29穩(wěn)定25100.10±10.960.440±0.0825.57±0.74穩(wěn)定5092.07±9.930.376±0.0622.10±2.42穩(wěn)定100102.63±17.460.380±0.1319.43±0.68穩(wěn)定150102.17±4.100.493±0.0918.40±1.25穩(wěn)定200116.81±27.910.398±0.0417.37±1.55穩(wěn)定

2.3 CS-PLs體外消化穩(wěn)定性

由圖7可知，在模擬胃環(huán)境中，PLs與CS-PLs隨著消化時(shí)間的延長，粒徑均略有增加，經(jīng)3 h消化后，其平均粒徑大小均能維持在120 nm以下，說明兩種脂質(zhì)體在酸性環(huán)境均能保持良好的穩(wěn)定性。由于加入的胃蛋白酶對(duì)脂質(zhì)體沒有影響，故測得模擬胃液中兩種脂質(zhì)體在不同消化時(shí)間段電位無顯著差別。在強(qiáng)酸性環(huán)境下，PLs所帶負(fù)電荷被中和，電位增加為-10 mV左右，而CS-LS自身帶正電荷，大量H+的存在屏蔽了殼聚糖表面所帶電荷，電位下降到30 mV。

圖7 模擬胃消化環(huán)境下脂質(zhì)體粒徑、電位變化

圖8 模擬腸消化環(huán)境下脂質(zhì)體粒徑、電位變化

在模擬腸液中，因加入的胰酶中含有一定量的胰脂肪酶，可水解脂質(zhì)體中的磷脂，破壞了脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)。如圖8所示，PLs在模擬腸液中，粒徑先增大，然后逐漸降低，磷脂分子層的破壞造成脂質(zhì)體粒徑增大，而腸液中含有大量膽鹽，在37 ℃條件下，大的顆粒會(huì)重新自組裝成微膠束，粒徑減小。Liu等[21]以大豆磷脂和牛奶磷脂制備脂質(zhì)體，在體外腸消化過程中也得到了相似的結(jié)果。PLs經(jīng)殼聚糖修飾后，脂質(zhì)體表面包裹了一層保護(hù)殼，降低了脂質(zhì)體與胰脂肪酶的接觸機(jī)會(huì)，從而可有效減輕脂質(zhì)體的破壞程度[22]。由結(jié)果可知，CS-PLs在中性環(huán)境中穩(wěn)定性較差，在模擬腸液環(huán)境中會(huì)形成沉淀物，但消化15 min后，混合物粒徑也逐漸降低，且較PLs具有更小的粒徑。

3 結(jié)論

本研究通過粒徑、電位等的測定，確定了殼聚糖修飾PLs的最佳質(zhì)量濃度為0.3 mg/mL；且發(fā)現(xiàn)pH、溫度、鹽粒子種類及其濃度均對(duì)CS-PLs穩(wěn)定性影響較大；所以選擇適宜的制備工藝和儲(chǔ)藏條件對(duì)維持脂質(zhì)體穩(wěn)定具有重要意義。在模擬胃環(huán)境中殼聚糖修飾前后PLs均表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，而模擬腸環(huán)境中，經(jīng)修飾后的PLs粒徑更小更穩(wěn)定。本研究對(duì)CS-PLs在不同條件下的穩(wěn)定性進(jìn)行了探討，為CS-PLs的進(jìn)一步研究和應(yīng)用提供參考。