張志軍，鹿 麟，牛法霞，趙 珂，姜梅杰，趙書平

(1 泰安市中心醫(yī)院, 山東 泰安 271000; 2 同濟大學(xué)附屬東方醫(yī)院, 上海 200120; 3 勝利油田中心醫(yī)院, 山東 東營 257000; 4 泰山醫(yī)學(xué)院, 山東 泰安 271016)

碳青霉烯類抗生素作為治療產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶及多重耐藥肺炎克雷伯菌感染的首選藥物受到廣泛關(guān)注，近年來隨著臨床上對該類藥物應(yīng)用的增加，耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae, CRKP)已呈全球性播散，對臨床感染的治療造成極大的威脅[1]。產(chǎn)碳青霉烯酶是肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類藥物耐藥的主要機制，碳青霉烯酶可廣泛水解包括碳青霉烯類在內(nèi)的所有β-內(nèi)酰胺類抗生素，并可隨著質(zhì)粒播散而導(dǎo)致大范圍的流行[2]。美國疾病控制與預(yù)防中心將CRKP列入了目前“最棘手的細(xì)菌”[3]。為此，本研究對2014年泰安市中心醫(yī)院臨床感染標(biāo)本中分離獲得的13株CRKP的耐藥基因攜帶情況及分子流行病學(xué)特點進行了分析，旨在為臨床治療此種細(xì)菌引起的感染提供實驗室依據(jù)，同時有助于及時有效的控制其流行。

1 資料與方法

1.1 資料來源 2014年1—11月醫(yī)院臨床各類標(biāo)本中分離的所有CRKP菌株(剔出同一患者相同部位檢出的重復(fù)菌株)，共計13株。

1.2 菌株鑒定與藥敏試驗 細(xì)菌的分離、培養(yǎng)嚴(yán)格按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》(第3版)進行，使用WalkAway 96 PLUS型全自動細(xì)菌分析儀進行鑒定和藥敏試驗，替加環(huán)素的敏感性使用Etest法。

1.3 改良Hodge試驗及EDTA 協(xié)同試驗 參照文獻[3]報道的方法進行檢測。

1.4 耐藥基因檢測 采用多聚酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)方法檢測碳青霉烯酶基因blaKPC、blaIMP、blaVIM、blaGIM、blaNDM-1等，引物序列參照文獻[4-5]，對陽性基因進行測序，PCR產(chǎn)物送上海桑尼生物科技有限公司進行檢測，結(jié)果進行BLAST序列比對分析。

1.5 脈沖場凝膠電泳(pulsed-field gel electrophoresis，PFGE)和多位點序列分型 (multilocus sequence typing，MLST) PFGE參照文獻[6]的方法進行，參考菌株為沙門菌H9812，應(yīng)用Gel Doc系統(tǒng)對圖像(Bio-Rad，美國)進行拍照。MLST中肺炎克雷伯菌7個管家基因的引物序列、反應(yīng)體系及反應(yīng)條件參見MLST網(wǎng)站，測序結(jié)果通過MLST數(shù)據(jù)庫進行比對，獲得該菌株相應(yīng)的序列型別(sequence type，ST)，使用eBURST軟件分析STs之間的進化關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 菌株檢出情況 13株CRKP的標(biāo)本來源主要是痰及尿，分別為7株(53.85%)和4株(30.77%)，1株(7.69%)分離自血標(biāo)本，1株(7.69%)分離自分泌物。CRKP主要來源于各重癥監(jiān)護病房(ICU)，其中神經(jīng)外科ICU、老年一科病房、急診科ICU、綜合ICU各檢出2株，血液內(nèi)科病房、口腔科門診、兒內(nèi)二科病房、新生兒ICU、泌尿外科病房各檢出1株。分離出CRKP菌株的患者多數(shù)有基礎(chǔ)性疾病、外傷或免疫力低下，病情較為嚴(yán)重，如腦出血、多器官損傷等，13株CRKP來源情況見表1。

表1 13株CRKP標(biāo)本來源、科室分布及患者情況Table 1 Specimen sources, department distribution, and patients’ condition of 13 CRKP strains

表2 CRKP對主要抗菌藥物的藥敏試驗結(jié)果[株數(shù)(%)]Table 2 Antimicrobial susceptibility testing results of CRKP(No. of isolates [%])

2.3 改良Hodge試驗及EDTA 協(xié)同試驗結(jié)果 13株CRKP改良Hodge試驗均為陽性；5株菌EDTA協(xié)同試驗陽性，分別為Kp4、Kp8、Kp9、Kp10與Kp12，其余為陰性。見圖1和圖2。

2.4 耐藥基因檢測結(jié)果 取KPC陽性基因PCR擴增產(chǎn)物進行測序，結(jié)果均為 KPC-2 基因，與編碼 CP028790.1序列100%同源，碳青霉烯酶基因中KPC-2型最常見(13/13)，見圖3。取NDM-1陽性基因PCR擴增產(chǎn)物進行測序，結(jié)果均為NDM-1 基因，與編碼CP028786.1序列100%同源，有5株細(xì)菌該基因陽性(5/13)，見圖4。未檢測到blaIMP、blaVIM、blaGIM基因。

圖1 部分改良Hodge試驗結(jié)果Figure 1 Modified Hodge test results of partial strains

圖2 部分EDTA協(xié)同試驗陽性結(jié)果Figure 2 Positive results of EDTA-disk synergy test of partial strains

注：M為DNA標(biāo)志物；Kp1—Kp13均為blaKPC基因陽性

注：M為DNA標(biāo)志物；Kp4、Kp8、Kp9、Kp10、Kp12為blaNDM-1基因陽性；Kp1—Kp3、Kp5—Kp7、Kp11、Kp13均為blaNDM-1基因陰性

2.5 PFGE分型及MLST結(jié)果 PFGE聚類結(jié)果顯示，以85%作為界值可將13株CRKP分為5種型別，分別為A、B、C、D、E型，主要為C型(9/13)，且均屬于ST11，其他型別為ST37、ST626、ST628和ST668，見圖5。eBURST軟件分析結(jié)果顯示檢出的ST11、ST37均屬于克隆復(fù)合體CC258群，見圖6。

圖5 13株CRKP的PFGE分型結(jié)果和MLST型別Figure 5 PFGE typing results and MLST of 13 strains of CRKP

注：紅色圓圈內(nèi)數(shù)值表示本次實驗中檢測到的ST類型；紅色方框內(nèi)表示克隆復(fù)合體CC258

3 討論

本研究中CRKP主要分離自各ICU及老年科病房，提示病情嚴(yán)重、體弱患者是主要的易感人群；這些菌株主要分離自痰，其次為尿，表明其主要定植在呼吸道，故應(yīng)加強可疑感染CRKP重癥患者的呼吸道細(xì)菌學(xué)檢查，及時發(fā)現(xiàn)CRKP有助于臨床用藥及治療，提高患者生存率。

大量研究[4-6, 10]表明，肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類藥物耐藥的機制主要有以下幾點：膜孔蛋白丟失，外排機制活躍，以及碳青霉烯酶的產(chǎn)生等，其中碳青霉烯酶(主要為KPC-2型碳青霉烯酶以及金屬β-內(nèi)酰胺酶)的產(chǎn)生是最主要的原因。然而，各地區(qū)間因抗菌藥物使用不同，耐藥基因的流行情況也存在一定差異。如張順等[11]對寧波地區(qū)分離的CRKP菌株進行檢測，發(fā)現(xiàn)KPC-2與IMP-4是該地區(qū)此類菌株中分離出的主要碳青霉烯酶基因，未發(fā)現(xiàn)NDM-1基因。王建友等[12]報道，樂清市地區(qū)3年間分離的CRKP菌株中，69.2%的菌株攜帶KPC-2型碳青霉烯酶，12.5%攜帶NDM-1基因，28.3%的菌株同時攜帶KPC-2和IMP-4，耐藥基因呈多態(tài)性。而在北美地區(qū)[13]，除KPC-2和NDM-1碳青霉烯酶基因的檢出率占絕對主導(dǎo)外，OXA-48型碳青霉烯酶的檢出率也逐漸增高，但與國內(nèi)不同。

13株CRKP均產(chǎn)KPC-2型碳青霉烯酶，說明KPC-2是該院肺炎克雷伯菌對亞胺培南等藥物耐藥的主要原因；5株(38.46%)細(xì)菌產(chǎn)NDM-1，且該5株菌EDTA協(xié)同試驗陽性，說明該試驗對金屬酶檢測的高度特異性；部分菌株同時攜帶兩種碳青霉烯酶基因(KPC-2與NDM-1)，說明該院碳青霉烯酶在肺炎克雷伯菌中呈現(xiàn)多態(tài)性，這是造成該院CRKP廣泛流行的根本原因，但同時攜帶兩種碳青霉烯酶基因的菌株其耐藥性與其他菌株并無明顯差別，可能是因為部分基因并未表達或僅存在低水平表達。

近年來，相關(guān)研究[3, 14-15]顯示，全球產(chǎn)KPC肺炎克雷伯菌的序列型主要為ST258，在美國、以色列和意大利流行。而國內(nèi)學(xué)者俞云松等[16]研究發(fā)現(xiàn)ST11是我國的優(yōu)勢序列類型，ST11與ST258間只有一個管家基因(tonB)存在差別，同屬于克隆復(fù)合體CC258。

本次研究結(jié)果顯示該院流行的CRKP也以克隆類型ST11為主，同時也發(fā)現(xiàn)了ST37與ST628等，與國內(nèi)的相關(guān)報道[6-7, 17]一致。PFGE結(jié)果顯示，分離自不同病房的CRKP菌株(如Kp5與Kp10)具有100%的同源性(均為ST11)，提示該院的此類菌株在一段時間內(nèi)存在暴發(fā)流行現(xiàn)象，由于菌株采集時間不同，來源科室也不同，可能由于醫(yī)護人員的流通或患者住院科室的流轉(zhuǎn)，滯留在物體表面或空氣中的病原菌感染了其他患者，因此，臨床醫(yī)生應(yīng)注意手衛(wèi)生與醫(yī)院感染防控，應(yīng)對該院碳青霉烯酶基因進行調(diào)查追蹤及分子流行病學(xué)的分析，有效掌控產(chǎn)不同碳青霉烯酶菌株的流行情況，為醫(yī)院感染進一步的防控提供堅實的實驗室基礎(chǔ)。

CRKP在中國、希臘、美國的檢出率較高[1, 3, 18]，在曾經(jīng)分離率很低的歐洲國家也逐漸出現(xiàn)流行，對此類細(xì)菌的監(jiān)測在相關(guān)感染預(yù)防控制中仍是一項重要措施。盡管各國的醫(yī)療機構(gòu)、科研中心甚至包括政府部門都對CRKP予以高度關(guān)注，但其整體流行趨勢尚未得到有效控制，因此，深入分析研究本地區(qū)分離的CRKP對碳青霉烯類抗生素的耐藥機制及流行病學(xué)特點，有助于進一步實施有針對性的預(yù)防控制措施。