白 蘭，鄭 宇

（1.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院，電子科技大學(xué)附屬醫(yī)院·四川省人民醫(yī)院，個(gè)體化藥物治療四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都610072；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 610075）

一貫煎是一種具有滋陰疏肝功效的中藥方。該方是由北沙參、麥冬、當(dāng)歸、生地黃、枸杞、川楝子六味中藥組成的，主要用于治療慢性肝炎、肝硬化、慢性萎縮性胃炎、胃及十二指腸球部潰瘍等疾病[1]。有研究者認(rèn)為[2-3]，除了多糖以外，一貫煎中的梓醇也屬于該方的有效成分。因此，本次實(shí)驗(yàn)使用ZTC1+1天然澄清劑Ⅲ型處理一貫煎的提取液，同時(shí)保留該方中的多糖及梓醇等非極性活性物質(zhì)，旨在尋找一種測(cè)定經(jīng)澄清劑處理后一貫煎中梓醇含量的有效方法?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 儀器與試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

本次實(shí)驗(yàn)使用的儀器是waters2690型正相高效液相色譜儀、2996型二極管陣列檢測(cè)器、美國(guó)waters公司生產(chǎn)的Empower Chromatography Manager 色譜數(shù)據(jù)工作站、德國(guó)Sartorius 公司生產(chǎn)的BP 211D 型十萬(wàn)分之一電子分析天平、蒸發(fā)皿、水浴鍋、恒溫鼓風(fēng)干燥箱等。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

本次實(shí)驗(yàn)使用的試劑是中國(guó)藥品生物制品檢定所生產(chǎn)的梓醇對(duì)照品、迪馬公司生產(chǎn)的甲醇（色譜純）、反滲透超純水、分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜條件

本次實(shí)驗(yàn)使用的色譜柱是迪馬公司生產(chǎn)的ShimpackCLC-ODS柱（6.00mm×15cm，5μm），其流動(dòng)相為甲醇-水（4:96），其檢測(cè)波長(zhǎng)為205nm，其流速為1.2 ml/min，其柱溫為28℃，其進(jìn)樣量為10μl。按照梓醇色譜峰計(jì)算理論塔板數(shù)，其理論塔板數(shù)應(yīng)不低于4000。

2.2 制備標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法

精密稱(chēng)取適量的梓醇對(duì)照品，將其加入到濃度為1%的甲醇中進(jìn)行溶解，將其配置成濃度為70μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.3 制備供試品溶液的方法

按照一貫煎的處方稱(chēng)取藥材，加10倍的清水煎煮2次，每次煎煮1.5 h。對(duì)所得的藥液進(jìn)行濾過(guò)處理。將兩次煎煮所得的藥液合并后，對(duì)這些藥液進(jìn)行濃縮處理，使藥材與藥液體積的比例為1:1，以備用。將濃縮后的藥液按照1:8的比例進(jìn)行稀釋?zhuān)缓髮?duì)其進(jìn)行水浴處理（溫度為80℃），并進(jìn)行攪拌。將稀釋后的濃縮液分為A組和B組。在這兩組溶液中分別加入ZTC 1+1天然澄清劑Ⅲ型。兩組溶液加入ZTC 1+1天然澄清劑Ⅲ型的間隔時(shí)間為120 min。A組溶液中ZTC 1+1天然澄清劑Ⅲ型的加入量為2%，B組溶液中ZTC 1+1天然澄清劑Ⅲ型的加入量為4%。將兩組溶液持續(xù)攪拌30 min后取出，將其放在4℃的環(huán)境中靜置24 h，對(duì)其進(jìn)行濾過(guò)處理。對(duì)濾液進(jìn)行濃縮，使藥材與藥液體積的比例為1:1，得到經(jīng)ZCT 1+1天然澄清液Ⅲ型處理后的一貫煎樣品。精密量取5 ml的一貫煎樣品，將其置于容量為25 ml的量瓶中。在量瓶中加入適量的甲醇。對(duì)量瓶中的溶液進(jìn)行超聲（功率250 W，頻率20 kHz）處理30 min，將溶液放冷。在量瓶中加入甲醇至刻度后，將量瓶中的溶液搖勻。使用直徑為0.45μm的微孔濾膜對(duì)溶液進(jìn)行濾過(guò)處理。精密量取1 ml的續(xù)濾液，將續(xù)濾液放到容量為10 ml的量瓶中，加水至刻度，然后將量瓶中的溶液搖勻，所得的藥液即為供試品溶液。按照一貫煎處方中藥物的用量稱(chēng)取除生地黃以外的其他藥材，參照上述方法制備陰性樣品溶液。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 進(jìn)行線性關(guān)系實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

分別精密量取 4.0μl、6.0μl、8.0μl、10.0μl、12.0μl的梓醇對(duì)照品溶液，將其分別注入到正相高效液相色譜儀中，測(cè)定梓醇對(duì)照品的峰面積。以梓醇對(duì)照品的峰面積作為縱坐標(biāo)，以梓醇對(duì)照品的進(jìn)樣量作為橫坐標(biāo)，求解梓醇對(duì)照品的線性回歸方程：Y= 1758758.98X+1115.60，r=0.9999。結(jié)果顯示，梓醇對(duì)照品的進(jìn)樣量在0.28～0.84μg時(shí)的線性關(guān)系良好。

3.2 進(jìn)行專(zhuān)屬性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

分別精密量取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液各10μl，將這些溶液注入到正相高效液相色譜儀中。結(jié)果顯示，在供試品溶液的色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相對(duì)應(yīng)的位置上，有相同的保留時(shí)間，且對(duì)陰性樣品溶液的色譜無(wú)干擾，說(shuō)明本法具有良好的專(zhuān)屬性。詳情見(jiàn)圖1。

圖1 一貫煎中梓醇的HPLC圖

3.3 進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

精密量取同一濃度的對(duì)照品溶液，按照2.1中的色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄并計(jì)算其峰面積。結(jié)果顯示，對(duì)照品溶液的RSD=1.02%，表明本法的精密度良好。

3.4 進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

精密量取5 ml的同一批樣品，按照2.3中的方法制備6份供試品溶液，在2.1中的色譜條件下，記錄并計(jì)算供試品溶液的峰面積。結(jié)果顯示，在供試品溶液中梓醇的含量為5.176 mg/ml時(shí)，其RSD=2.06%，說(shuō)明本法的重復(fù)性良好。

3.5 進(jìn)行穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

取3.3中的一份供試品溶液，在2.1中的色譜條件下，在第0 h、第2 h、第4 h、第8 h、第12 h時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，記錄并計(jì)算供試品溶液的峰面積。結(jié)果顯示，供試品溶液的RSD=1.91%，說(shuō)明供試品溶液在常溫下放置12 h的穩(wěn)定性良好。

3.6 進(jìn)行加樣回收率實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

分別精密量取2.5 ml 已知含量的9份同一批樣品，將其分為三組，每組3份樣品。在每組樣品中分別加入一定量的對(duì)照品溶液，按照2.3中的方法制備供試品溶液，在2.1中的色譜條件下記錄供試品溶液的峰面積，計(jì)算供試品溶液的回收率。結(jié)果顯示，供試品溶液的平均回收率為102.46%，其RSD=1.96%。

3.7 進(jìn)行樣品濃度實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

取3批樣品，分別按照2.3的方法制備供試品溶液，在2.1的色譜條件下進(jìn)樣，使用外標(biāo)法計(jì)算樣品中梓醇的含量。結(jié)果顯示，樣品中梓醇的含量分別為5.176 mg/ml、5.386 mg/ml、4.908 mg/ml。

4 討論

在進(jìn)行本次實(shí)驗(yàn)時(shí)，課題組參考了相關(guān)文獻(xiàn)，使用不同比例的乙腈和水作為流動(dòng)相，或在供試品溶液中加入不同濃度的磷酸溶液，分離的效果均不理想。這可能是由于在經(jīng)澄清劑處理后的一貫煎供試品溶液中保留的多糖成分可對(duì)梓醇含量的測(cè)定造成影響。經(jīng)過(guò)更換色譜柱、改變流動(dòng)相的組成及比例等方式，課題組最終找到一種測(cè)定經(jīng)澄清劑處理后一貫煎中梓醇含量的有效方法，即正相高效液相色譜法。該檢測(cè)方法的專(zhuān)屬性強(qiáng)，測(cè)定的結(jié)果準(zhǔn)確，可為對(duì)一貫煎制劑的定量控制提供參考。