李學鵬，劉晏瑋，高郡煥，朱文慧，勵建榮,*，張玉玉，李鈺金，林 洪

四角蛤蜊（Mactra veneriformis）屬蛤蜊科，是我國沿海主要的低值貝類[1]。四角蛤蜊肉質細膩，滋味鮮美，除含有蛋白質、氨基酸、脂肪酸等多種營養(yǎng)成分外，還富含核苷酸、糖原、有機酸等多種呈味物質，是開發(fā)海鮮調味品的理想原料。目前，我國對四角蛤蜊等低值貝類的加工一般以干制、冷凍為主，這些傳統(tǒng)加工方法產品形式單一，且附加值低，如何實現此類低值貝類的高值化利用和精深加工成為貝類加工產業(yè)發(fā)展亟待解決的問題[2]。通過蛋白酶酶解技術可將四角蛤蜊等低值貝類制成富含氨基酸和多肽的水解物，同時兼具呈味和營養(yǎng)功能，是開發(fā)高附加值、功能性調味品的關鍵途徑[3]。朱蘊菡[4]研究發(fā)現四角蛤蜊酶解物具有良好的血管緊張素轉化酶抑制活性和一定的羥自由基清除能力。張開偉[5]發(fā)現四角蛤蜊酶解液中的多肽抗氧化活性顯著。但現有研究主要集中在四角蛤蜊的酶解工藝和酶解液中肽的活性研究等方面，對酶解液進行風味改良以此來開發(fā)海鮮調味品的研究相對較少。美拉德反應是游離氨基酸、多肽或蛋白質的氨基與還原糖的羰基之間發(fā)生的一種復雜反應，其反應產物包括揮發(fā)性香氣物質、Strecker醛類物質和大分子質量棕黑色聚合物，這些產物在食品風味的形成中起著重要作用[6]。據報道，美拉德反應中分子質量較小的交聯產物可以明顯提高產品的持續(xù)感和醇厚感[7]。Dunkel等[8]利用美拉德反應產物作為風味增強劑來改善食品的口感和鮮味。Yu Min等[9]發(fā)現豆粕水解液通過美拉德反應后鮮味氨基酸含量增加，苦味氨基酸含量下降，具有很好的感官特性。通常情況下，直接酶解水產蛋白質獲得的水解液存在風味不良等特點，可通過美拉德反應增香技術對其進行風味改良[10-11]。此外，研究表明美拉德反應產物還具有一定的抗氧化活性[12-15]，在改良底物風味的同時可提高其營養(yǎng)功能。鑒于此，本研究以四角蛤蜊酶解液為原料，通過美拉德反應改良其風味，以感官評定、美拉德反應程度及色差為指標，研究還原糖的種類、復合比例與添加量、反應溫度、反應時間和反應體系初始pH值對美拉德反應產物風味特性的影響，并對反應前后的酶解液中氨基酸和揮發(fā)性風味成分進行對比分析，以確定較優(yōu)的美拉德反應工藝條件，為制備海鮮調味基料和開發(fā)高品質海鮮調味品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活四角蛤蜊購于錦州市林西街水產市場。

中性蛋白酶（0.8 AU/g）、復合蛋白酶（1.5 AU/g）（均為食品級） 諾維信（中國）生物技術有限公司；D-葡萄糖、乳糖（均為食品級） 阿拉丁試劑有限公司；D-木糖、果糖、蔗糖（均為食品級） 國藥集團化學試劑有限公司；氫氧化鈉（分析純） 天津市風船化學試劑科學有限公司；鹽酸（分析純） 錦州古城化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

DK-8D電熱恒溫水槽 上海一恒科技有限公司；Biofuge?Stratos臺式高速冷凍離心機 美國賽默飛世爾科技公司；UV-2550紫外-可見分光光度計 日本島津公司；JY-10型小型粉碎機 濟南九陽有限公司；FE20-FiveEasy? pH計、PL602-L型分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；DHG-9123A電熱恒溫鼓風干燥 上海一恒科學儀器有限公司；CR-400色差儀 柯尼卡美能達集團；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鄭州長城科工貿有限公司；7890N/5975氣相色譜-質譜聯用儀、1260高效液相色譜儀 美國Agilent公司；20 mL頂空鉗口樣品瓶、固相微萃取裝置、50/30 μm二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）萃取頭 美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 四角蛤蜊酶解液的制備

采用實驗室前期確定的復合酶酶解工藝進行制備[16]。酶解條件為：料液比1∶4（g/mL）、蛋白酶添加質量分數2.4‰、中性蛋白酶-復合蛋白酶質量比2∶1、酶解時間5.5 h、酶解溫度52 ℃。酶解結束后升溫至95 ℃保持15 min進行滅酶，得到四角蛤蜊酶解液。

1.3.2 美拉德反應改良四角蛤蜊酶解液風味反應條件的確定

1.3.2.1 還原糖種類對酶解液美拉德反應產物風味的影響

取40 g酶解液于50 mL的錐形瓶中，分別添加木糖、乳糖、葡萄糖、果糖、蔗糖（其分解產生的單糖具有還原性）1.0 g，調節(jié)pH值至7.0，100 ℃反應60 min，冷卻后進行感官評定。

1.3.2.2 木糖與葡萄糖最適復合比例的確定

取40 g酶解液于50 mL的錐形瓶中，加糖1.0 g（木糖和葡萄糖添加質量比分別為2∶1、1∶1、1∶2、1∶4、1∶6），調節(jié)pH值至7.0，100 ℃反應60 min，冷卻后進行感官評定。

1.3.2.3 反應溫度的確定

取40 g酶解液于50 mL的錐形瓶中，加糖1.0 g（木糖-葡萄糖1∶2，m/m），調節(jié)pH值至7.0，分別在80、90、100、110、120 ℃條件下反應60 min，冷卻后進行感官評定。

1.3.2.4 反應時間的確定

取40 g酶解液于50 mL的錐形瓶中，加糖1.0 g（木糖-葡萄糖1∶2，m/m），調節(jié)pH值至7.0，分別在100 ℃條件下反應20、40、60、80、100、120 min，冷卻后進行感官評定。

1.3.2.5 反應體系初始pH值的確定

取40 g酶解液于50 mL的錐形瓶中，加糖1.0 g（木糖-葡萄糖1∶2，m/m），分別調節(jié)pH值至5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，100 ℃反應80 min，冷卻后進行感官評定。

1.3.2.6 正交試驗優(yōu)化美拉德反應條件

在單因素試驗的基礎上，以感官評分為指標，選擇反應時間、反應溫度、反應體系初始pH值和還原糖添加量4 個因素設計正交試驗，如表1所示。

表1 L9（34）正交試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels used for orthogonal array design

1.3.3 美拉德反應產物的感官評價

請6 名（3 男、3 女）受過專門訓練的感官評定員組成一個感官評定小組，并對每個待評樣品用3 位數字進行隨機編號，評定員根據具體的感官評定標準（表2）進行打分。

表2 感官評定標準Table 2 Sensory evaluation criteria

1.3.4 美拉德反應程度的測定

1.3.4.1 低分子質量香味中間體形成程度的測定

據文獻[17]報道，美拉德反應產物中的低分子質量香味中間體在波長280 nm處有特定吸收峰，吸光度可以指示其生成程度，A280nm越大越好。將經美拉德反應后的四角蛤蜊酶解液進行抽濾，濾液稀釋100 倍，以超純水為參比，在波長280 nm處測定其吸光度。

1.3.4.2 褐變程度測定

美拉德反應的最后階段生成類黑精物質，在波長420 nm處有吸收[18]。將美拉德反應產物稀釋10倍，以超純水為參比，在420 nm波長處測定其吸光度，檢測美拉德反應的褐變程度。每次實驗做3 個平行，結果表示為 ±s。

1.3.5 色差的測定

將經美拉德反應后的四角蛤蜊酶解液進行抽濾，稀釋10 倍，取6 mL反應液，用色差計測其L*、a*、b*值。以四角蛤蜊酶解液為對照，按下式計算其色差ΔE。每次實驗做6 個平行，結果用 ±s表示[19]。

1.3.6 氨基酸含量的測定

準確稱取一定量（0.5～1.0 g）的樣品于水解管中，加入6 mol/L的鹽酸12 mL，加入少量新蒸餾的苯酚，向管中充入高純的氮氣，馬上擰緊蓋子，放入110 ℃烘箱水解22 h。用去離子水定容到50 mL，取適量定容好的溶液，減壓干燥至干，加少量去離子水，重復減壓干燥2 次，用超純水定容備用。采用高效液相色譜儀測定，進樣前樣品經OPA FMOC柱前衍生，過0.22 μm濾膜。測定條件為：Hypersil ODS C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫40 ℃；流速1.0 mL/min；紫外檢測器波長338、262 nm（Pro、Hypro）；流動相：A相為40 mmol/L Na2HPO4，用8 mol/L氫氧化鈉溶液調pH值為7.8，B相為乙腈-甲醇-水（45∶45∶10，V/V）。梯度洗脫程序：0～17.0 min，B相0%～60%；18.0～20.0 min，B相60%～100%；23 min后B相為0%。

1.3.7 揮發(fā)性化合物的測定

樣品前處理：準確稱取0.5 g四角蛤蜊酶解物，用去離子水定容到50 mL，取4 mL樣品于20 mL頂空瓶中，加入磁轉子，迅速用聚四氟乙烯隔墊密封，60 ℃磁力攪拌加熱平衡20 min后，用已老化好的50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭頂空吸附30 min，將萃取頭插入氣相色譜進樣口，解吸5 min。

氣相色譜條件：HP-5MS毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進樣口溫度250 ℃，不分流模式進樣；載氣為He，流速1.0 mL/min；不分流模式進樣；程序升溫：柱初溫35 ℃，保持2 min，以3 ℃/min升至120 ℃，保持1 min，再以6 ℃/min升至250 ℃，保持6 min。

質譜條件：電子電離源；接口溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；質量掃描范圍m/z 30～550。

1.4 數據處理

采用SPSS 19.0軟件進行數據方差分析和顯著性檢驗，采用Origin 8.5軟件進行數據作圖。樣品中揮發(fā)性成分結果分析采用峰面積歸一化法計算出各揮發(fā)性化合物的相對含量。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 還原糖種類對四角蛤蜊酶解液美拉德反應產物風味的影響

圖1 還原糖種類對美拉德反應產物風味的影響Fig. 1 Effect of sugar type on the sensory score of MRPs

表3 還原糖種類對美拉德反應產物吸光度和色差的影響Table 3 Effect of sugar type on absorbance values and color difference

美拉德反應主要是還原糖和氨基酸之間的反應，不同還原糖的反應活性和增香效果不同。常見糖的反應活性順序為D-木糖＞L-阿拉伯糖＞己糖（D-果糖、D-甘露糖、D-半乳糖和D-葡萄糖）＞二糖（蔗糖、乳糖、麥芽糖）[20]。本研究選擇了常見的幾種糖（木糖、乳糖、葡萄糖、果糖、蔗糖）進行美拉德反應。由圖1和表3可知，糖的種類對四角蛤蜊酶解液美拉德反應產物的風味影響較大。木糖的感官評分最高，葡萄糖次之，蔗糖最差。木糖在波長280 nm和420 nm的吸光度也最高，顏色的變化也最大，即美拉德反應程度最強，蔗糖次之。由于木糖的成本較高，且美拉德反應的色澤影響較大，而葡萄糖的美拉德反應程度較低，但其反應液的色澤較好，口感也較好，所以將葡萄糖和木糖復配來進行美拉德反應。

2.1.2 還原糖復合比例對四角蛤蜊酶解液美拉德反應產物風味的影響

由圖2和表4可知，當木糖與葡萄糖的添加比例為1∶2時，酶解液的感官評分結果最高，且在波長280 nm處表現為最高的的吸光度。這表明此比例下發(fā)生的美拉德反應生成了較高含量的低分子質量香味中間體，從波長420 nm處的吸光度和色差值也可以看出，此時酶解液的美拉德反應適中，色澤良好。綜合考慮，選擇木糖與葡萄糖添加比例1∶2為較佳的復配比例。

圖2 木糖與葡糖糖添加比例對美拉德反應產物風味的影響Fig. 2 Effect of different ratios of xylose to glucose on the sensory score of MRPs

表4 木糖與葡萄糖添加比例對美拉德反應產物吸光度和色差的影響Table 4 Effect of different ratios of xylose to glucose on absorbance values and color difference

2.1.3 反應溫度對四角蛤蜊酶解液美拉德反應產物風味的影響

圖3 不同反應溫度對美拉德反應產物風味的影響Fig. 3 Effect of reaction temperature on the sensory score of MRPs

表5 不同反應溫度對美拉德反應產物吸光度和色差的影響Table 5 Effect of reaction temperature on absorbance values and color difference

美拉德反應受溫度的影響很大，溫度相差10 ℃，褐變速度相差3～5 倍[21]。由圖3可知，在選定的溫度范圍內，四角蛤蜊酶解液美拉德反應產物感官評分呈現先上升后下降的趨勢，當溫度為100 ℃時，感官評分最高。由表5可知，隨著反應溫度的升高，美拉德反應程度增大，色差也增大。溫度低于100 ℃，美拉德反應程度較低，產物特征香味不明顯；當溫度高于100 ℃時，低分子質量香味中間體含量較高，但感官評分下降，可能是因為美拉德反應程度較大，類黑精物質生成較多，掩蓋了原有的海鮮風味[22-23]。因此選擇100 ℃為美拉德反應溫度。

2.1.4 反應時間對四角蛤蜊酶解液美拉德反應產物風味的影響

由表6可知，隨著反應時間的延長，美拉德反應液在波長280 nm和420 nm處的吸光度逐漸增大，色差也逐漸增大，即美拉德反應程度逐漸增大，這與董志儉等[24]的研究結果相同。但由圖4可知，隨著反應時間的延長，美拉德反應液的感官評分呈現先上升后下降的趨勢，反應時間過長，口感變差，分值降低。當反應時間為80 min時，感官評分最高，所以選擇80 min為美拉德反應時間。

表6 反應時間對美拉德反應產物吸光度和色差的影響Table 6 Effect of reaction time on absorbance values and color difference

圖4 反應時間對美拉德反應產物風味的影響Fig. 4 Effect of reaction time on the sensory score of MRPs

2.1.5 反應體系初始pH值對四角蛤蜊酶解液美拉德反應產物風味的影響

圖5 反應體系初始pH值對美拉德反應產物風味的影響Fig. 5 Effect of initial pH on the sensory score of MRPs

表7 反應體系初始pH值對美拉德反應產物吸光度和色差的影響Table 7 Effect of initial pH on absorbance values and color difference

美拉德反應體系的初始pH值能夠嚴重影響美拉德反應的進行[25-26]。由圖5、表7可知，酶解液初始pH值在弱酸和弱堿性范圍，美拉德反應后的感官評分均呈現一個較高點。當初始pH值為6.5時，感官評分最高。此時A280nm最大，即低分子質量香味中間體產生最多。因此選擇6.5為美拉德反應的初始pH值。

2.1.6 還原糖添加量對四角蛤蜊酶解液美拉德反應產物風味的影響

圖6 還原糖添加量對美拉德反應產物風味的影響Fig. 6 Effect of amount of reducing sugar on the sensory score of MRPs

表8 還原糖添加量對美拉德反應產物吸光度和色差的影響Table 8 Effects of amount of reducing sugar on absorbance values and color difference

由圖6和表8可知，隨著還原糖添加量的增加，美拉德反應程度增大，色差也變大，但其感官評分呈現先上升后下降的趨勢。當還原糖添加量為3.5%時，感官評分最高，當還原糖添加量超過3.5%時，美拉德反應后酶解液口感偏甜，影響整體風味，感官評分下降。

2.2 正交試驗結果

表9 正交試驗設計及結果Table 9 Orthogonal array design with response variable

在單因素試驗的基礎上，選擇反應體系初始pH值、反應溫度、反應時間和還原糖添加量為影響因素，設計正交試驗，對美拉德反應工藝進行優(yōu)化。根據表9中各因素的極差大小可知，4 個因素對產品感官評分的影響順序為反應溫度（B）＞反應體系初始pH值（C）＞反應時間（A）＞還原糖添加量（D）；根據各因素間感官評分和極差分析可知，美拉德反應的最優(yōu)組合為A3B2C2D3，即反應時間90 min、反應溫度100 ℃、反應體系初始pH 6.5、還原糖添加量4.0%。在此條件下，與感官評分最優(yōu)組合進行驗證實驗，優(yōu)化后其感官評分為23.68±0.21，為最佳風味組合。

2.3 美拉德反應前后酶解液中氨基酸的變化

表10 美拉德反應前后酶解液中氨基酸組成和含量的變化Table 10 Changes in amino acid composition after the reaction%

氨基酸（尤其是游離氨基酸）對海鮮調味基料的呈味起著重要的作用。如表10所示，美拉德反應前的酶解液中共檢測出18 種氨基酸成分，游離氨基酸總量為20.475%，氨基酸總量為53.629%。游離氨基酸中含量較高的5 種氨基酸為丙氨酸、亮氨酸、牛磺酸、精氨酸和甘氨酸，其中丙氨酸的含量最豐富，約占游離氨基酸總量的21.97%，是重要的甜味氨基酸。呈鮮味的氨基酸主要為天冬氨酸和谷氨酸，分別占游離氨基酸總量的1.49%和5.15%。組氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸為呈苦味的氨基酸，此類氨基酸約占游離氨基酸總量的27.84%。精氨酸、胱氨酸、蛋氨酸、賴氨酸和脯氨酸是既帶有苦味，又帶有甜味，約占游離氨基酸總量的21.62%。?；撬峒s占游離氨基酸總量的9.92%，它可以增加食品體系呈味的柔和性、層次性和總體滋味[27]。

不同種類的氨基酸參與美拉德反應的難易程度不同，不同的氨基酸與葡萄糖反應會產生的香氣也不同，如組氨酸反應無明顯香氣，蛋氨酸呈馬鈴薯味，異亮氨酸和亮氨酸呈溫和的面包皮味，苯丙氨酸呈焦糖味，賴氨酸呈烤馬鈴薯味，此外，甘氨酸、丙氨酸和纈氨酸和葡萄糖與木糖都可形成醬香風味[28]。由表10可以看出，美拉德反應后，酶解液中游離氨基酸總量、總氨基酸含量和各游離氨基酸含量均有較大程度的減少，其中丙氨酸、甘氨酸、?；撬岷凸劝彼岬膿p失率較大，其次是組氨酸、精氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、賴氨酸，說明這些氨基酸可能是參與美拉德反應并對反應產物風味起主要作用的氨基酸。

2.4 美拉德反應前后酶解液中揮發(fā)性化合物的變化

圖7 美拉德反應前后揮發(fā)性化合物的總離子流圖Fig. 7 Total ionic chromatogram of volatile compounds before and after Maillard reaction

表11 美拉德反應前后主要揮發(fā)性化合物及其相對含量Table 11 Main volatile compounds and their relative contents before and after Maillard reaction

續(xù)表11

續(xù)表11

用固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用技術對揮發(fā)性風味成分進行提取，測定其揮發(fā)性化合物的總離子流圖如圖7所示。通過譜庫檢索，并結合有關文獻，采用峰面積歸一化法計算出各化合物的相對含量，結果見表11。美拉德反應前檢測出47 種揮發(fā)性風味物質，美拉德反應后檢測出48 種揮發(fā)性風味物質。雖然揮發(fā)性化合物的總數相差不大，但是化合物的種類和相對含量有所差異。其中醛類、酮類和酯類物質增加，烯烴類物質降低。此外，還生成了一些酸類物質、醇類物質和酚類物質。

醛類是四角蛤蜊中種類最多、相對含量最豐富的揮發(fā)性風味物質，對其香氣貢獻也最大。與美拉德反應前相比，醛的種類和相對含量均有所增加。其中相對含量較高的醛類物質有苯乙醛、苯甲醛、壬醛、異戊醛、庚醛、（E）-2-辛烯醛、己醛、庚醛、十二醛、十五醛和十四醛三聚物等。這些醛類物質主要是一些分子質量較高的醛和不飽和醛。據報道，5～9 個碳原子的醛具有清香、油香、脂香風味[29]。不飽和醛大多數具有清香，令人愉悅的氣味[30]。苯乙醛的相對含量最高，約為17.20%，這可能是構成肉香味的組成成分。

美拉德反應后共檢測出6 種酮類物質，比美拉德反應前有所增加。其中相對含量較高的有2-壬酮、甲基壬基甲酮和2,5-辛二酮等。在貝類中發(fā)現的甲基酮（C3～C17）可能是由其碳鏈的β氧化，再經脫羧作用形成的，這些化合物具有明顯的水果香和清香，其花香味隨著碳鏈的增長而更加顯著[31]。酯類物質的種類和相對含量也有所增加，共檢測出5 種酯類物質。其中相對含量較大、對四角蛤蜊海鮮調味基料的香氣起主要貢獻的有草酸酰胺乙酯、甲酸庚酯和鄰苯二甲酸二丁酯。一般認為這些酯類物質是通過羧酸和醇的酯化作用形成的，通常具有甜的果香，可以柔和樣品的整體風味[32]。

烯烴類物質的種類和相對含量均低于美拉德反應前。從實驗結果可以看出，（＋）-長葉環(huán)烯、異長葉烯、長葉烯的相對含量在美拉德反應后未檢出，這可能是因為烯烴類物質易氧化和揮發(fā)，其種類和相對含量會隨著反應溫度的升高而減少[29]。

此外，美拉德反應后生成的酸、醇和酚類物質對酶解液風味有一定的影響[33]。但因其相對含量較少，對風味的貢獻不大。

3 結 論

利用單因素試驗和正交試驗確定美拉德反應改良四角蛤蜊酶解液風味的工藝條件為木糖與葡萄糖比例1∶2，還原糖添加量4.0%，反應體系初始pH6.5，100 ℃反應90 min。在此條件下，酶解液風味得到了較大改善，鮮香味濃郁。美拉德反應后，酶解液中18 種氨基酸均有不同程度的損失，其中丙氨酸、甘氨酸、牛磺酸和谷氨酸的損失率較大，其次是組氨酸、精氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、賴氨酸，說明這些氨基酸可能是參與美拉德反應及對反應產物風味起主要作用的氨基酸。美拉德反應前后揮發(fā)性化合物的數量相差不大，種類和相對含量有所差異。其中醛類、酮類、酯類物質增加，烯烴類物質降低，此外，反應還生成了一些酸類物質、醇類物質和酚類物質。