錢麗麗，宋雪健，張東杰,*，張麗媛，阮長青，鹿保鑫

地理標(biāo)志作為一項(xiàng)知識產(chǎn)權(quán)已經(jīng)得到國際認(rèn)可并受到保護(hù)[1-2]。素有“貢米”之稱的五常大米及“中國綠色米都”建三江種植建三江大米因其籽粒飽滿晶瑩剔透，營養(yǎng)豐富，清香適口等特點(diǎn)被評為地理標(biāo)志大米[3]，備受消費(fèi)者青睞，具有廣闊的市場前景。一些不法商販以此為“良機(jī)”開始制售假大米，以謀取利益，嚴(yán)重?fù)p壞了地理標(biāo)志大米的品牌效益，并擾亂了市場秩序。因此，為實(shí)現(xiàn)對地理標(biāo)志大米的產(chǎn)地保護(hù)研究，開發(fā)一種快速鑒別地理標(biāo)志大米技術(shù)是亟待解決的問題之一。目前，對大米產(chǎn)地溯源的研究技術(shù)主要有電子鼻技術(shù)[4]、電子舌技術(shù)[5]、礦物元素指紋分析技術(shù)[6]、DNA指紋分析技術(shù)[7]、電感耦合等離子技術(shù)[8]、拉曼光譜技術(shù)[9]、近紅外光譜技術(shù)[10]等。與其他技術(shù)相比較近紅外光譜具有快速、高效、無損、適用范圍廣等特點(diǎn)。

近紅外光譜分析技術(shù)是利用近紅外譜區(qū)包含的豐富的物質(zhì)信息，同時(shí)吸收帶的吸收強(qiáng)度與分子組成或化學(xué)基團(tuán)的含量有關(guān)可用于測定化學(xué)物質(zhì)的成分和分析物理性質(zhì)[11]，對于多組分的復(fù)雜樣品，其近紅外光譜也不是各組分單獨(dú)光譜的簡單疊加，因此，近紅外光譜技術(shù)需要結(jié)合“化學(xué)計(jì)量法”對光譜信號進(jìn)行處理，從而提取食品中的有效信息[12]，其研究結(jié)果較為理想。近紅外光譜的采集方式主要有透射式、漫反射式、透漫射式3 種，在對固體樣品光譜采集時(shí)多以漫反射為主，而其他兩種方式多用于液體樣品的光譜采集。范積平等[13]研究發(fā)現(xiàn)利用近紅外漫反射光譜技術(shù)能實(shí)現(xiàn)對來自甘肅、青海、陜西的大黃藥材進(jìn)行產(chǎn)地鑒別。Sinelli等[14]通過傳統(tǒng)感官評價(jià)方法并結(jié)合近紅外漫反射光譜技術(shù)對112 組初榨橄欖油進(jìn)行了產(chǎn)地溯源研究，發(fā)現(xiàn)采用線性判別式分析和簇獨(dú)立軟模式分類法對初榨橄欖油產(chǎn)地的判別正確率分別為71.6%、100%。也有學(xué)者將近紅外漫反射技術(shù)用于小米[15]、小麥[16]、茶葉[17]等產(chǎn)地溯源。目前，應(yīng)用近紅外漫反射光譜技術(shù)對大米研究多集中在品質(zhì)檢測及少量單一年份產(chǎn)地判別，鮮見應(yīng)用該技術(shù)對多年際大米進(jìn)行產(chǎn)地溯源的研究。本研究采用近紅外漫反射光譜技術(shù)對多年份大米進(jìn)行產(chǎn)地溯源研究，為地理標(biāo)志大米產(chǎn)地保護(hù)研究提供理論研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

于2013—2015年采集建三江、五常地區(qū)及2015年試驗(yàn)田的樣品，均為田間采樣，采用3 點(diǎn)隨機(jī)取樣的方式進(jìn)行采集，每份樣本采集2 kg裝入尼龍網(wǎng)兜，并記錄采樣信息，所有水稻品種均為粳米。除試驗(yàn)田樣品外，其余均歸為隨機(jī)樣品。樣本詳細(xì)信息見表1、2。

表1 試驗(yàn)田樣品信息Table 1 Information about rice samples from experimental field

表2 隨機(jī)采樣樣品信息Table 2 Information about randomly collected rice samples

1.2 儀器與設(shè)備

FC2K礱谷機(jī) 日本大竹制作所；VP-32實(shí)驗(yàn)?zāi)朊讬C(jī)日本山本公司；FW100高速萬能粉碎機(jī) 天津泰斯特儀器有限公司；TENSORII型傅里葉變換近紅外光譜儀（漫反射鍍金積分球、InGaAs檢測器） 德國布魯克（北京）科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 水稻試驗(yàn)田的構(gòu)建

于2015年，以粳稻主產(chǎn)區(qū)黑龍江?。ㄎ宄?、建三江、查哈陽）為試驗(yàn)點(diǎn)，建立3 塊試驗(yàn)田。每塊試驗(yàn)田種植主栽中晚熟品種9 個(gè)分別為空育131、龍粳31、龍粳26、龍粳29、龍粳39、龍粳40、松粳9、五優(yōu)稻4號、綏粳4，各試驗(yàn)田育苗移栽、秧田管理、施肥、灌溉均按當(dāng)?shù)厣a(chǎn)習(xí)慣，所有品種同期播種。采用3 次重復(fù)隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，小區(qū)面積不少于10 m2。四周設(shè)保護(hù)行，保護(hù)行品種與各對應(yīng)品種相同。

1.3.2 樣品的前處理

采集回來的樣品經(jīng)過晾曬、去石、脫粒等前處理后，在實(shí)驗(yàn)室采用統(tǒng)一加工方式對其進(jìn)行壟谷、碾米、粉碎、過篩（100 目），待測。每個(gè)樣品礱谷2 次。碾米的進(jìn)樣量為3 次，碾米3 次，白度為3 次。

1.3.3 樣品原始光譜的采集

將傅里葉變換近紅外光譜儀預(yù)熱30 min，打開OPUS 7.5軟件經(jīng)由檢查信號、保存峰位，掃描背景單通道光譜，每間隔1 h掃描一次背景來消除外界信息干擾保證光譜的穩(wěn)定性以減少誤差。將樣品粉末倒入玻璃杯中，用壓樣器壓實(shí)，測量樣品單通道采集樣品光譜。環(huán)境溫度為室溫（25±1）℃，相對濕度為20%～30%，光譜波數(shù)范圍12 000～4 000 cm－1，分辨率8 cm－1，掃描64 次。

1.3.4 樣品選取

試驗(yàn)田樣品用于與產(chǎn)地因素有關(guān)的特征波段篩選。其余樣品則選擇各地區(qū)樣品總量的2/3作為建模樣品用于模型的建立，1/3作為預(yù)測樣品集用于模型的驗(yàn)證。各地區(qū)用于建模和預(yù)測的樣品數(shù)見表3。

表3 建模與預(yù)測樣品Table 3 Modeling and prediction set samples

1.3.5 試驗(yàn)田近紅外光譜數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用OPUS 7.5軟件分別對試驗(yàn)田樣品的原始光譜進(jìn)行一階導(dǎo)數(shù)預(yù)處理消除噪聲、基線漂移、光色散等因素的干擾及防止過擬合現(xiàn)象的出現(xiàn)，應(yīng)用SPSS 19.0軟件對試驗(yàn)田樣品進(jìn)行方差分析篩選出與產(chǎn)地有關(guān)的波段，并用于隨機(jī)樣品產(chǎn)地溯源研究。

1.3.6 模型的建立及驗(yàn)證

1.3.6.1 定性分析模型建立

采用OPUS 7.5軟件在特征波段下利用因子化法和歐式距離法對隨機(jī)樣品進(jìn)行定性分析模型建立研究，預(yù)處理方式分為矢量歸一化（standard normal variate，SNV）、一階導(dǎo)數(shù)＋平滑（5、9、13、17、21、25 點(diǎn)，下同）、一階導(dǎo)數(shù)＋SNV＋平滑、二階導(dǎo)數(shù)＋平滑、二階導(dǎo)數(shù)＋SNV＋平滑等，消除無關(guān)信息的干擾，提高模型的精度。通過比較選擇性S值最終確定定性分析模型的建立方法，其中S值表征樣品之間的距離，當(dāng)S值小于1時(shí)，表示兩類樣品“相交”，樣品未被均一鑒別；當(dāng)S值為1時(shí)，表示兩類樣品“相切”；當(dāng)S值大于1時(shí)，表示兩類樣品“相離”，樣品被均一鑒別，故S值越大于1，模型的效果越好。同時(shí)利用因子化法和歐式距離法對隨機(jī)樣品進(jìn)行聚類分析模型建立研究，預(yù)處理方式與上述相同。并通過比較樣品之間的“距離”大小確定建模方法，其中樣品之間的“距離”越大越好。

1.3.6.2 定量分析模型建立

采用留1交叉檢驗(yàn)的檢驗(yàn)方法以偏最小二乘（partial least squares，PLS）法在特征波段進(jìn)行定量分析模型的建立，分別將建三江大米的組分值賦值為－1、五常大米的組分值賦值為1，以0為衡量標(biāo)準(zhǔn)，預(yù)測值小于0為建三江大米、預(yù)測值大于0為五常大米[18]。原始光譜的預(yù)處理方式有消除常數(shù)偏移量、減去一條直線、SNV、最小-最大歸一化、多元散射矯正（multiplicative scatter correction，MSC）、內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)、一階導(dǎo)數(shù)＋平滑、二階導(dǎo)數(shù)＋平滑、一階導(dǎo)數(shù)＋減去一條直線＋平滑、一階導(dǎo)數(shù)＋SNV＋平滑、一階導(dǎo)數(shù)＋多元散射校正＋平滑，通過交互驗(yàn)證均方根誤差（root mean square error of cross validation，RMSECV）及定向系數(shù)（R2）來衡量模型的好壞，其中R2數(shù)值越接近100%則預(yù)測含量值越接近真值；RMSECV數(shù)值越小越好；同時(shí)RMSECV先隨維數(shù)的增大快速下降后略微逐漸增大，模型效果較好，進(jìn)而確定定量分析模型。

1.3.6.3 模型驗(yàn)證

利用OPUS 7.5軟件分別選擇定性分析、聚類分析、定量分析工具欄，調(diào)入模型，調(diào)入預(yù)測樣品光譜圖，測定得出結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 大米近紅外原始光譜分析結(jié)果

圖1 試驗(yàn)田樣品（A）和隨機(jī)樣品（B）近紅外原始光譜圖Fig. 1 NIR Spectra of experimental field samples (A) and random samples (B)

大米近紅外原始光譜如圖1所示，在波段為7 500～9 000 cm-1處（I區(qū)）是C—H第3組合頻區(qū)，其中8 321 cm-1附近的吸收峰是由脂肪烴中甲基（—CH）基團(tuán)引起的；5 500～7 500 cm-1處（II區(qū)）是C—H第2組合頻區(qū)，在6 846 cm-1附近的吸收峰是因—CH2二級振動所引起的，因與樣品中氨基酸種類及含量有關(guān)，所以較I區(qū)信息稍微強(qiáng)些；4 000～5 500cm-1處（III區(qū)）是C—H第1組合頻譜區(qū)，是表征蛋白質(zhì)及淀粉物質(zhì)中的N—H、C—H、O—H及C＝O鍵振動的要區(qū)間，其中5 173 cm-1處的吸收峰與其有關(guān)[19]。不同產(chǎn)地及不同品種之間的近紅外光譜相似，采用一階導(dǎo)數(shù)對試驗(yàn)田原始光譜預(yù)處理后進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明，不同地區(qū)來源的樣品在波段5 136～5 501 cm-1處均有顯著差異，說明不同地區(qū)間樣品的近紅外光譜存在顯著性差異。在特征波段對大米進(jìn)行產(chǎn)地溯源研究具有較強(qiáng)的代表性[20]。

2.2 不同預(yù)處理方式對定性分析建模效果的影響

近紅外光譜雖然包含了豐富的物質(zhì)信息，但譜峰重疊、信號較弱、譜帶較寬，難以像中紅外光譜那樣進(jìn)行結(jié)構(gòu)剖析，因此近紅外光譜的定性分析主要用于物質(zhì)的種屬判別，即通過比較未知樣品與已知樣本或標(biāo)準(zhǔn)樣本的光譜確定未知樣品的歸屬[21]。在特征波段5 136～5 501 cm-1范圍內(nèi)分別采用因子化法和歐式距離法對隨機(jī)樣品的原始光譜進(jìn)行定性建模分析，如表4所示。結(jié)果表明，采用因子化法結(jié)合二階導(dǎo)數(shù)＋SNV＋5 點(diǎn)平滑的預(yù)處理方式建立的模型效果較好，兩地區(qū)的樣品被均一鑒別，其中模型的S值為1.324 005，故選此方法建立定性分析模型，如圖2所示。王夢東等[22]利用近紅外漫反射光譜技術(shù)結(jié)合因子化法在特征波段7 400～9 900 cm-1范圍內(nèi)采用二階導(dǎo)數(shù)＋矢量歸一化＋21 點(diǎn)平滑對白茶、紅茶及烏龍茶進(jìn)行判別研究，研究發(fā)現(xiàn)采用近紅外漫反射光譜技術(shù)結(jié)合因子化法在3類茶葉的判別中具有可行性。張敏等[23]研究發(fā)現(xiàn)，利用近紅外漫反射光譜技術(shù)結(jié)合因子化法在特征波段4 482～5 238、5 369.1～6 950.5 cm-1范圍內(nèi)采用一階導(dǎo)數(shù)＋矢量歸一化＋13 點(diǎn)平滑的預(yù)處理方式能實(shí)現(xiàn)對來自6 個(gè)地區(qū)的雞血藤的產(chǎn)地溯源判別研究。

表4 不同預(yù)處理方式對定性分析模型效果影響Table 4 Effects of different pretreatment methods on qualitative analysis model

通過對原始光譜進(jìn)行主成分分解，選取特征值較大的幾個(gè)主成分得分特征變量參與模式識別，在進(jìn)來保留有用信息的前提下，不僅壓縮了原始光譜，而且這些變量是沿最大方差方向得到的，還起到特征信息提取的作用。而標(biāo)準(zhǔn)算法采用的是歐式距離，直接使用吸光度計(jì)算光譜距離，不能體現(xiàn)特征變量的變化情況。因此，采用因子化法建立的模型精度要優(yōu)于歐式距離法。

圖2 因子化法2D得分圖Fig. 2 2D score plot by factorization method

2.3 不同預(yù)處理方式對聚類分析建模效果的影響

表5 不同預(yù)處理方式對聚類分析模型效果影響Table 5 Effects of different pretreatment methods on clustering analysis model

圖3 不同地區(qū)大米樣品的聚類分析結(jié)果Fig. 3 Cluster analysis of different geographical rice samples

聚類分析用于判定一系列近紅外譜圖的相似性，是根據(jù)樣本自身的屬性，用數(shù)學(xué)方法按照某種相似性或差異性指標(biāo)確定樣本之間的親疏關(guān)系，并按這種親疏關(guān)系程度對樣本進(jìn)行聚類。與定性分析不同，它不需要輸入任何信息，聚類分析只將相似光譜按組分類[24]。在特征波段5 136～5 501 cm-1范圍內(nèi)分別采用因子化法和歐式距離法對隨機(jī)樣品的原始光譜進(jìn)行聚類建模分析，如表5所示。結(jié)果表明，采用因子化法結(jié)合二階導(dǎo)數(shù)＋SNV＋5 點(diǎn)平滑的預(yù)處理方式建立的模型效果較好，兩地區(qū)樣品被正確分類，且“距離”為0.918 00，如圖3所示。故選此方法建立聚類分析模型。龐艷蘋等[25]利用近紅外漫反射光譜技術(shù)因子化法在4 000～8 003.8 cm-1范圍內(nèi)采用二階導(dǎo)數(shù)＋5 點(diǎn)平滑的預(yù)處理方式對255 份草莓進(jìn)行產(chǎn)地溯源研究，結(jié)果表明，其模型的預(yù)測正確率高達(dá)96.70%。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在特征波段4 000～7 500 cm-1范圍內(nèi)采用因子化法結(jié)合一階導(dǎo)數(shù)＋矢量歸一化＋17 點(diǎn)平滑的預(yù)處理方法建立的模型能夠?qū)崿F(xiàn)對久保桃的產(chǎn)地鑒別[26]。

2.4 不同預(yù)處理方式對定量分析建模效果的影響

建立定量分析模型的目的是對多組分樣品的相關(guān)組分進(jìn)行定量分析。首先需要選擇能夠代表待測體系的已知組分的建模樣品，然后用這些樣品的近紅外光譜和組分值來擬合模型，經(jīng)過檢驗(yàn)其預(yù)測的可靠性之后，這個(gè)模型就可用來分析未知樣品的組分值[27]。PLS法將用來尋找光譜與濃度數(shù)據(jù)矩陣之間的最佳相關(guān)函數(shù)關(guān)系，具有更易于辨識系統(tǒng)信息與噪聲的優(yōu)點(diǎn)，使其擬合的模型精度更高[28]。在特征波段5 136～5 501 cm－1范圍內(nèi)采用PLS法結(jié)合交叉檢驗(yàn)法對原始光譜進(jìn)行處理，如表6所示。結(jié)果表明，采用一階導(dǎo)數(shù)＋MSC＋13 點(diǎn)平滑的預(yù)處理方式建立的模型效果較好，其RMSECV為0.105，R2為98.97%，維數(shù)為4，故選此方法來建立定量分析模型。如圖4、5所示。汪靜靜等[29]研究發(fā)現(xiàn)利用近紅外漫反射光譜技術(shù)在特征波段7 559～8 531 cm－1范圍內(nèi)采用二階導(dǎo)數(shù)＋MSC＋5 點(diǎn)平滑建立的定量分析模對來自3 個(gè)地區(qū)的74 份人參樣品進(jìn)行產(chǎn)地判別，其正確率高達(dá)90%。趙艷麗等[30]在波段4 007.35～7 135.33 cm－1，采用近紅外漫反射光譜技術(shù)結(jié)合PLS判別分析法對3 個(gè)不同產(chǎn)區(qū)的70 份野生藥用植物重樓建立判別模型，其預(yù)測正確率為100%。

表6 不同預(yù)處理方式對定量分析模型效果影響Table 6 Effect of different pretreatment methods on quantitative analysis model

圖4 地區(qū)預(yù)測值與參考值相關(guān)圖Fig. 4 Predicted value versus reference value

圖5 RMSECV與維數(shù)的關(guān)系圖Fig. 5 RMSECV against dimensionality

2.5 大米產(chǎn)地溯源模型驗(yàn)證

將建立好的定性分析模型、聚類分析模型及定量分析模型分別帶入OPUS 7.5軟件中，對預(yù)測樣品進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明，定性分析模型對建三江大米及五常大米的正確判別率分別為100%、98%。聚類分析模型對建三江大米及五常大米的正確判別率分別為97.92%、98.00%。定量分析模型對建三江大米及五常大米的正確判別率分別為95.83%、94.00%，如表7所示。

表7 模型鑒別結(jié)果Table 7 Results of model validation

3 結(jié) 論

對大米進(jìn)行產(chǎn)地溯源判別研究易受到產(chǎn)地、品種、施肥量等因素的影響，故為篩選與產(chǎn)地有關(guān)的因素實(shí)驗(yàn)于2015年在黑龍江五常、佳木斯、齊齊哈爾三地建立試驗(yàn)田，進(jìn)行特殊波段的篩選，通過對試驗(yàn)田樣品進(jìn)行一階導(dǎo)數(shù)處理得出特征波數(shù)范圍為5 136～5 501 cm-1。在特征波段范圍內(nèi)對2013年至2015年來自建三江地區(qū)及五常地區(qū)的291 份大米進(jìn)行產(chǎn)地溯源研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用因子化法結(jié)合二階導(dǎo)數(shù)＋SNV＋5 點(diǎn)平滑的預(yù)處理方式建立的定性分析模型對建三江大米及五常大米的正確判別率分別為100%、98%。采用因子化法結(jié)合二階導(dǎo)數(shù)＋矢量歸一化＋5 點(diǎn)平滑的預(yù)處理方式建立的聚類分析模型對建三江大米及五常大米的正確判別率分別為97.92%、98.00%。采用PLS法結(jié)合一階導(dǎo)數(shù)＋MSC＋13 點(diǎn)平滑的預(yù)處理方式建立的定量分析模型對建三江大米及五常大米的正確判別率分別為95.83%、94.00%。其中定性分析與聚類分析的最優(yōu)處理方法相一致。故應(yīng)用近紅外漫反射光譜技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對多個(gè)年份大米的產(chǎn)地鑒別。大米產(chǎn)地溯源受多種因素影響，今后可以從土壤、基因型、施肥量等多種因素進(jìn)行研究。