劉 姚，韋倩妮，王 弘，楊金易，孫遠明，徐振林，沈 興，李向梅，雷紅濤*

氯霉素（chloramphenicol，CAP）又稱氯胺苯醇，是一種常用的廣譜抗生素，結構式如圖1所示。1947年，在Streptomyces Venezuelae的培養(yǎng)液中首次分離得到CAP[1]，其抑菌機制是通過與原核細胞內(nèi)的50S核糖體亞基結合，抑制蛋白質(zhì)的合成從而抑制微生物的生長繁殖[2]。CAP具有抗菌效果明顯、價格低廉等優(yōu)點，因此廣泛應用于畜牧業(yè)中，治療畜禽腸道感染疾病[3]。近年來，許多研究表明CAP的過度攝入會威脅人類健康，國際癌癥研究機構將CAP歸為2A組，表明CAP或許對人類致癌；CAP還能抑制人體的造血系統(tǒng)，引起血細胞減少、灰嬰綜合癥和再生障礙性貧血[4]。因此，歐盟、美國、日本等國家和地區(qū)均規(guī)定在食品中禁止使用CAP[5]。歐盟設定在肉類、雞蛋、牛奶、水產(chǎn)品和蜂蜜中CAP的最低要求的性能限制為0.3 μg/kg[6]。然而CAP的違規(guī)使用依然廣泛存在，為有效監(jiān)控食品中CAP的含量，有必要對CAP進行嚴格的檢測。

圖1 CAP分子結構式Fig. 1 Structure of chloramphenicol

蜂蜜作為一種天然的甜味劑，廣泛用作營養(yǎng)品[7]。有研究表明，蜂蜜富含酚醛樹脂、揮發(fā)性物質(zhì)、有機酸、丙酮醛、過氧化氫酶等，具有抗菌抗氧化活性[8]。與其他天然食品一樣，蜂蜜容易受到環(huán)境的污染，如重金屬、農(nóng)藥、抗生素污染。常用于檢測蜂蜜中CAP的方法有液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[9-12]、氣相色譜[13]等，雖然靈敏度高，但是儀器昂貴、樣品前處理復雜，且不適用于大量樣品的篩查。近年來基于抗原-抗體特異性識別的基礎上發(fā)展的免疫檢測方法有表面等離子共振[14-16]、免疫傳感器[17-19]、免疫層析試紙條[20]、多點納米矩陣[21]、光敏比色免疫測定[22]等廣泛用于蜂蜜中CAP的檢測。酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）因其操作簡便被廣泛用于樣品初分析和現(xiàn)場篩查[7]。

中國是世界上最大的蜂蜜生產(chǎn)、消費和出口國，2015年國家統(tǒng)計局數(shù)據(jù)顯示中國產(chǎn)蜂蜜達50萬 t，其中出口量占28.6%，國內(nèi)消費占69.3%。為保障消費者健康安全和蜂蜜出口貿(mào)易的順利進行，亟需研究開發(fā)蜂蜜中CAP高靈敏度快速檢測試劑盒。目前，國外普遍采用商業(yè)化的直接競爭ELISA試劑盒對CAP殘留進行檢測，直接競爭ELISA具有靈敏度高和操作簡單的優(yōu)點；常用的試劑盒主要來源于德國r-Biopharm公司、英國RANDOX公司及荷蘭Euro-Diagnostica公司[23]。國內(nèi)關于CAP的殘留ELISA檢測試劑盒的研發(fā)，主要集中在間接ELISA試劑盒，僅有少數(shù)是直接競爭法ELISA試劑盒[24]；直接競爭法ELISA采用的包被原有羊抗兔IgG抗體（二抗）[25]和CAP單克隆抗體[26]。本研究在已獲得高特異性CAP單克隆抗體的基礎上，對CAP直接競爭ELISA方法進行優(yōu)化，為進一步研制蜂蜜中CAP殘留直接競爭ELISA檢測試劑盒提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

抗CAP單克隆抗體、CAP-辣根過氧化物酶標記物、3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，TMB）由廣東省食品安全重點實驗室制備并保存；蜂蜜（經(jīng)儀器檢測不含CAP） 市購；CAP標準品上海孟成科技有限公司；羊抗鼠IgG 武漢博士德生物公司；96 孔可拆卸酶標板 廈門美宜佳公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

包被液：Na2CO31.69 g和NaHCO32.95 g，用蒸餾水定容至1 L；抗體稀釋液：PBST（含0.05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS））；底物顯色液：TMB顯色液；終止液為10%硫酸溶液；洗液：Na2HPO4·12H2O 3.0 g、NaCl 8.5 g、吐溫20 0.5 mL，用蒸餾水定容至1 L；磷酸鈉緩沖液（phosphate buffer，PB）、PBS和硼酸緩沖液（硼液）均由實驗室配制。

1.2 儀器與設備

Multiskan酶標儀、Wellwash 4MK2洗板機 美國Thermo公司；6K-15冷凍離心機 美國Sartorius-Sigma公司；82-5控溫磁力攪拌器 金壇市恒豐儀器廠；DK-8D電熱恒溫水槽 上海醫(yī)用恒溫設備廠；R2100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 無錫申科生物技術有限公司；HY-4調(diào)速多用振蕩器 金壇市順華儀器有限公司；KQ-50DA型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 直接競爭ELISA基本步驟

包被：用包被液將包被抗體稀釋到合適濃度，加入96 孔板中，100 μL/孔，孵育過夜。封閉：使用洗液洗板2 次，拍干，每孔加入120 μL封閉液，37 ℃孵育3 h，甩干孔中的液體，置于37 ℃烘箱中1 h備用。抗原-抗體反應：每孔各加入50 μL的標準品與50 μL的酶標記抗原，37 ℃水浴孵育一定時間。洗板：用洗滌液洗滌6 次。加底物液：每孔各加入底物液緩沖液50 μL和底物液50 μL，顯色10 min。終止反應：每孔各加入終止液50 μL，在酶標儀上測量波長450 nm處各孔吸光度。

1.3.2 標準品稀釋液的確定

用不同稀釋液（去離子水、PBST、PBS、PB液）配制CAP標準溶液，質(zhì)量濃度分別為0.000、0.005、0.015、0.045、0.135、0.405、1.215、3.645、10.935、32.805、98.415 ng/mL和295.245 ng/mL。按照1.3.1節(jié)步驟進行測定，以CAP標準品質(zhì)量濃度負對數(shù)為橫坐標，以A450nm為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.3 包被溫度的確定

分別在4 ℃和37 ℃包被過夜（12 h）。按照1.3.1節(jié)步驟測定，選擇靈敏度較高、曲線斜率較大的溫度為最佳包被溫度。

1.3.4 包被抗體稀釋倍數(shù)的確定

將包被抗體分別稀釋不同倍數(shù)（1∶3 000、1∶4 000、1∶5 000、1∶6 000），于4 ℃包被過夜。按照1.3.1節(jié)步驟測定A450nm，繪制標準曲線。

1.3.5 酶標抗原稀釋液的確定

分別使用PBST、PB液與硼液稀釋酶標抗原，測定A450nm，繪制標準曲線。

1.3.6 酶標抗原稀釋倍數(shù)確定

將酶標抗原分別按1∶2 000、1∶3 000、1∶4 000稀釋倍數(shù)加入到酶標孔中，按1.3.1節(jié)步驟測定，繪制標準曲線。

1.3.7 競爭時間的確定

按照1.3.1節(jié)步驟，在加入藥物與酶標抗原后，于37 ℃分別競爭反應20、25、30、40 min后顯色，測定A450nm，繪制標準曲線。

1.3.8 直接競爭ELISA標準曲線的建立

由以上ELISA條件優(yōu)化過程確定出各個因素的最佳值，按照1.3.1節(jié)步驟測定A450nm，以CAP標準品質(zhì)量濃度負對數(shù)為橫坐標，以A450nm為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.9 樣品前處理方法的優(yōu)化

1.3.9.1 提取方法的優(yōu)化

振蕩提?。悍Q取蜂蜜樣品3 g，加3 mL蒸餾水，振蕩均勻，再加6 mL乙酸乙酯，振蕩15 min。5 000 r/min離心10 min。吸取上層液2 mL。45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸干，加1 mL正己烷溶解殘留物，再加1 mL PBS復溶。去除上層正己烷，取下層清液50 μL待測。

超聲提?。悍Q取樣品3 g，加3 mL蒸餾水，振蕩均勻，再加6 mL乙酸乙酯，超聲15 min。5 000 r/min離心10 min。吸取上層2 mL。45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸干，加1 mL正己烷溶解殘留物，再加1 mL PBS復溶。去除上層正己烷，取下層清液50 μL待測。

1.3.9.2 提取時間的確定

稱取樣品3 g，共設4 組。每組加3 mL蒸餾水，振蕩均勻，再加6 mL乙酸乙酯，然后每組分別振蕩5、10、20、30 min。5 000 r/min離心10 min。吸取上層2 mL。45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸干，加1 mL正己烷溶解殘留物，再加1 mL PBS復溶。去除上層正己烷，取下層清液50 μL待測。

1.3.10 蜂蜜樣品中CAP的檢出限和定量限

取20 份空白樣品，按照已確定的步驟進行測定，計算檢出質(zhì)量濃度的平均值C0以及標準偏差SC0。檢出限為C0加上3 倍的SC0，定量限為C0加上10 倍的SC0。

1.3.11 添加回收實驗

在樣品中添加不同水平（0.3、1、3 ng/mL）的CAP標準品，按照樣品前處理方法對樣品進行處理。分別按照已優(yōu)化的方法進行ELISA檢測，并計算回收率。

1.3.12 重復性實驗

對于所建立CAP的ELISA檢測方法進行重復性考察，分別以批內(nèi)與批間誤差來表示。批內(nèi)變異測定：每一標準品質(zhì)量濃度作8 次重復，以其批內(nèi)變異系數(shù)表示批內(nèi)誤差；批間變異測定：按照最佳檢測條件分別作標準曲線，取不同批次包被的酶標板，每個標準品質(zhì)量濃度每天作一次分析，連續(xù)進行7 d測定，綜合7 d測得質(zhì)量濃度進行分析，以其批間變異系數(shù)表示批間誤差。

2 結果與分析

2.1 最佳反應條件

2.1.1 標準品稀釋液的確定

圖2 CAP標準品稀釋液的優(yōu)化Fig. 2 Optimization of dilution of chloramphenicol standard

如圖2所示，使用蒸餾水或者PB溶液配制標準溶液進行ELISA實驗時，A450nm值偏低，而用PBS或PBST可提高A450nm值，且使用PBS時，IC50值低而Amax/IC50高，可能原因是PBS溶液具有一定離子強度，有較好的緩沖能力，使用其作為標準品稀釋液進行ELISA反應時，不會破壞緩沖體系的pH值和離子濃度，因此選擇PBS稀釋標準品檢測效果最佳。

2.1.2 包被溫度的確定

圖3 包被溫度的優(yōu)化Fig. 3 Optimization of coating temperature

如圖3所示，采用4℃包被過夜，A450nm值和Amax/IC50較高，并且比37 ℃包被更靈敏?？贵w在37 ℃包被過程中，由于孵育時間偏長，部分蛋白變性，而4 ℃長時間孵育更有利與抗體充分吸附到固相載體上并保持抗體活性，因此選擇4 ℃為最佳的包被溫度。

2.1.3 包被抗體稀釋倍數(shù)的確定

圖4 抗體稀釋倍數(shù)的優(yōu)化Fig. 4 Optimization of antibody dilution

如圖4所示，當包被抗體稀釋倍數(shù)達到1∶4 000時，隨著稀釋倍數(shù)的提高，曲線靈敏度并沒有明顯變化，但A450nm值和Amax/IC50值逐漸降低，因此，選擇1∶4 000作為包被抗體最佳稀釋倍數(shù)。

2.1.4 酶標抗原稀釋液的確定

如圖5所示，用PBST稀釋酶標記抗原，其檢測值較低，但靈敏度和Amax/IC50最高，而其余2 種稀釋液效果相當，可能原因是PBST的成分對于非特異性蛋白的競爭性結合的抑制作用更為明顯，故選擇PBST作為抗體稀釋緩沖液。

圖5 酶標抗原稀釋液的優(yōu)化Fig. 5 Optimization of dilution solution for enzyme labeled antigen

2.1.5 酶標抗原稀釋倍數(shù)的確定

圖6 酶標抗原稀釋倍數(shù)的優(yōu)化Fig. 6 Optimization of dilution degree of enzyme labeled antigen

如圖6所示，隨著酶標記抗原稀釋倍數(shù)的提高，A450nm值和IC50值降低，Amax/IC50升高。當稀釋倍數(shù)達到1∶4 000時，各個參數(shù)達最佳水平。因此酶標記抗原最佳稀釋倍數(shù)為1∶4 000。

2.1.6 競爭時間的確定

圖7 競爭時間的優(yōu)化Fig. 7 Optimization of competition time

如圖7所示，隨著競爭時間延長，檢測值隨時間的延長呈平穩(wěn)上升趨勢，Amax/IC50先升高再降低，在25 min處達到最高值。IC50值變化較為顯著，在20～20 min內(nèi)IC50值較低，但此后隨競爭時間延長，IC50值急劇升高。因此ELISA反應最佳競爭時間為25 min。

2.1.7 標準曲線的建立

按照上述ELISA條件優(yōu)化結果，得到CAP直接競爭ELISA方法的最佳反應條件，即：包被抗體稀釋倍數(shù)1∶4 000，包被溫度4 ℃，酶標記抗原稀釋緩沖液為PBST，稀釋倍數(shù)1∶4 000，最佳競爭時間25 min。

根據(jù)波長450 nm處吸光度，以CAP標準品質(zhì)量濃度負對數(shù)為橫坐標，以A450nm為縱坐標，繪制標準曲線。標準曲線的回歸方程為y=-17.425x＋97.509，相關系數(shù)R2為0.991 2，IC50為0.63 ng/mL。線性范圍（IC20～IC80）為0.10～4.17 ng/mL。

2.2 樣品前處理方法的優(yōu)化

2.2.1 提取方式的確定結果

表1 蜂蜜不同提取方式添加回收率實驗結果Table 1 Recoveries of chloramphenicol from honey samples using different extraction methods

如表1所示，采用超聲提取和振蕩提取2 種方式提取樣品中的CAP，提取得率相差不大。振蕩提取更為簡便，因此確定振蕩提取為樣品前處理方式。

2.2.2 提取時間的確定結果

表2 不同提取時間添加回收率實驗結果Table 2 Recoveries of chloramphenicol from spiked honey samples with different extraction times

如表2所示，不同提取時間條件下，樣品的添加回收率均在90%～120%之間。5 min已可將樣品中的CAP幾乎完全提取出來。組織樣品等其他樣品的基質(zhì)成分較蜂蜜更為復雜，為確保盡可能完全提取出各類樣品中的CAP，又不至于使處理時間過長，故選擇提取時間為10 min。

2.3 方法確證

2.3.1 蜂蜜樣品中CAP的檢出限和定量限結果

按照ELISA條件優(yōu)化結果，本實驗選取20 份空白蜂蜜樣品，按照直接競爭ELISA方法測定。蜂蜜樣品的檢出限和定量限分別為0.15 ng/g和0.33 ng/g。

2.3.2 準確度結果

本實驗對蜂蜜樣品中CAP添加回收進行測定，如表3所示。選取3 個添加水平，分別為0.3、1 ng/g和3 ng/g，其回收率分別為100.94%、100.81%和97.58%，且批間和批內(nèi)變異系數(shù)均小于11%，表明該方法準確度高。

表3 蜂蜜樣品CAP添加回收實驗結果Table 3 Recovery and precision of chloramphenicol from spiked honey sample

2.3.3 精密度結果

如表4所示，當CAP質(zhì)量濃度為0.1 ng/mL時，變異較大，當質(zhì)量濃度在0.3～8.1 ng/mL范圍內(nèi)，變異系數(shù)均小于10%，表明該方法重復性較好。

表4 批內(nèi)變異（n=8）Table 4 Inter-assay coefficients of variation of the standard curve (n = 8)

表5 批間變異（n=7）Table 5 Inter-assay coefficients of variation of the standard curve (n = 7)

如表5所示，不同時間內(nèi)建立的標準曲線，IC50的變異系數(shù)均小于10%，表明所建立的方法重復性較好。

3 討 論

ELISA方法的建立往往需要對反應條件進行優(yōu)化[27-31]。郭逸蓉等[24]利用抗氯霉素琥珀酸單酯多克隆抗體作為包被原，建立CAP殘留直接競爭ELISA檢測試劑盒；采用方陣實驗法，對包被多克隆抗體和酶標半抗原的稀釋度進行優(yōu)化，研究結果表明：所建立的直接競爭ELISA試劑盒對CAP的檢測線（IC10）和線性范圍分別為0.47 ng/mL和0.24～250 ng/mL，在蝦肉、雞肉、蜂蜜和鮮奶中的檢測線為1～2 μg/kg，檢測反應過程需要80 min左右。張立辰等[26]利用CAP單克隆抗體為包被原，優(yōu)化了樣品稀釋液的離子強度和pH值，建立海產(chǎn)品中CAP殘留直接競爭ELISA檢測方法，其檢測線IC15為（0.10±0.03） ng/mL，檢測反應過程也需要80 min左右。Guo Lingling等[20]為建立CAP間接競爭ELISA檢測方法，對包被原、甲醇濃度、NaCl含量、pH進行了優(yōu)化，結果表明IC20～IC80為0.11～1.36 ng/mL。

本實驗對CAP標準品稀釋液、包被溫度、包被抗體稀釋倍數(shù)、酶標抗原稀釋液、酶標抗原稀釋倍數(shù)和競爭時間6 個單因素進行優(yōu)化，建立最優(yōu)CAP直接競爭ELISA方法，優(yōu)化后的反應條件為：包被抗體稀釋倍數(shù)1∶4 000，包被溫度4 ℃，酶標記抗原稀釋緩沖液為PBST，稀釋倍數(shù)1∶4 000，最佳競爭時間25 min。在此條件下，建立的ELISA方法檢出限可達（0.04±0.01） ng/mL，檢測范圍為0.10～4.17 ng/mL，檢測反應時間需要40 min左右，滿足國內(nèi)外規(guī)定的CAP檢出限。同時蜂蜜空白樣品的檢出限和定量限分別是0.15 ng/g和0.33 ng/g，回收率分別為97.58%、100.81%和100.94%，滿足實際檢測的需要。與前人CAP直接競爭ELISA檢測方法相比，本研究所建立的方法檢測限更低、檢測反應過程耗時更短。

直接競爭ELISA法靈敏度高、操作簡單，可同時進行大量樣品的檢測，非常適合現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣本初篩。本研究建立的蜂蜜中CAP殘留直接競爭ELISA檢測方法，耗時短、靈敏度高，經(jīng)液相色譜-質(zhì)譜、氣相色譜-質(zhì)譜等儀器法進一步確定后，有望給直接競爭ELISA法試劑盒的商品化帶來理論參考依據(jù)。