王雅寧 藺 超 劉云啟 高金祥 劉益濤 高 潔

(濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腎內(nèi)科,山東 濱州 256603)

在長期腹膜透析過程中，腹膜結(jié)構(gòu)和功能的改變與腹膜血管生成密切相關(guān)，越來越多證據(jù)表明，腹腔局部血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的上調(diào)是其中心環(huán)節(jié)〔1，2〕。成人VEGF主要通過與其受體VEGFR1(Flt-1)、VEGFR2(Flk-1/KDR)結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。此外，F(xiàn)lt-1基因尚編碼一種可溶性的形式sFlt-1，其與VEGF有很強的親和性，與之結(jié)合后即阻斷VEGF的一系列分子生物學(xué)效應(yīng)〔3〕。與長期腹膜透析腹膜損害有關(guān)的諸多因素，如透析液的生物不相容性、葡萄糖降解產(chǎn)物(GDP)、腹腔慢性炎癥等均可影響腹腔局部VEGF表達〔4〕。本文旨在探討不同腹膜透析液對大鼠腹膜間皮細胞(RPMCs)VEGF及其受體表達及分泌的影響。

1 材料和方法

1.1材料 清潔級SD雄性大鼠，體重150～180 g，由山東大學(xué)實驗動物中心提供。主要試劑：DMEM/F12培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS，美國Gibco)，Trizol試劑(Ambion公司)，腹膜透析液(美國Baxter公司)，RT試劑盒(Fermentas公司)，雞抗大鼠VEGFR2抗體(Prosci公司)，兔抗大鼠VEGFR1抗體(Labvison公司)，小鼠抗大鼠GAPDH抗體、小鼠二抗、兔二抗(美國CST公司)，雞二抗(Upstate公司)，鼠VEGF及sFlt-1酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(R&D公司)。

1.2RPMCs的分離培養(yǎng)及鑒定 取SD雄性大鼠，腹腔內(nèi)注射含0.25%胰酶及0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)溶液進行消化。120 min后無菌操作下剖開大鼠腹腔，吸取腹腔內(nèi)液體，置15 ml離心管，1 500 r/min離心10 min，棄上清。DMEM/F12(含0.5%FBS)洗滌1次，離心棄上清。加入含12%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，將細胞打散為均勻懸浮液，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待90%～95%細胞融合，消化傳代。第2代細胞經(jīng)形態(tài)鑒定及抗細胞角蛋白抗體、抗Ⅷ因子抗體免疫組織化學(xué)鑒定，確定為腹膜間皮細胞后，用于下游試驗。

1.3不同腹膜透析液對RPMCs VEGF及其受體表達的影響 穩(wěn)定培養(yǎng)的第1代RPMCs消化傳代，同步化培養(yǎng)24 h后，分別以不同腹膜透析液〔1.50%葡萄糖腹膜透析液(dextrose)(低糖組)、2.50% dextrose(中糖組)、4.25% dextrose(高糖組)、7.50% icodextrin(糊精組)〕進行刺激培養(yǎng)，無血清DMEM為陰性對照(對照組)，刺激24 h后收集細胞，提取核酸及蛋白以供檢測。

1.4RT-PCR檢測RPMCs的VEGF、VEGFR1、VEGFR2和sFlt-1 mRNA表達 沖洗RPMCs后，按照Trizol試劑盒說明書提取細胞總RNA，隨后取2 μg RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA?；蛐蛄型ㄟ^GenBank獲得，引物設(shè)計由PRIMER5.0軟件按照引物要求完成，由上海英駿公司合成。VEGF：上游 5′-CCACGACAGAAGGGGAGCA-3′，下游5′-ACACCGCATTAGG GGCACA-3′；VEGFR1：上游5′-CAAGGGACTCTACAC TTGTC-3′，下游5′-CCGAATAGCGAGCAGATTTC-3′；VEGFR2：上游5′-GCCAATGAAGGGGAACTGAAGAC-3′，下游5′-TCTGACTGCTGGTGATGCTGTCA-3′；sFlt-1：上游5′-AATCTGCTCGCTATTCGGTG-3；下游5′-GTGGGTAGAGAGGTGGGCTT-3′；GAPDH：上游5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。反應(yīng)結(jié)束后取10 μl PCR產(chǎn)物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳，溴乙錠(EB)染色，凝膠成像系統(tǒng)成像及進行掃描定量分析，以其所測得積分吸光度與內(nèi)參照GAPDH積分吸光度的比值代表半定量值。

1.5Western印跡檢測RPMCs的VEGFR1、VEGFR2蛋白表達 裂解細胞后，置于冰上，4℃ 10 000 r/min離心10 min，收集上清，測蛋白濃度。取20 μl總蛋白上樣于7%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳分離，濕法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫1 h。分別加入兔抗大鼠VEGFR1抗體，雞抗大鼠VEGFR2抗體，小鼠抗大鼠GAPDH抗體，4℃孵育過夜。以辣根過氧化物酶(HRP)標記的相應(yīng)二抗孵育1 h，洗膜；電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影，自動成像系統(tǒng)成像并分析。

1.6ELISA檢測RPMCs培養(yǎng)上清中VEGF及sFlt-1蛋白表達 收集細胞培養(yǎng)上清，離心去除細胞碎片。15 min內(nèi)加完所有樣本，具體步驟按照說明書進行。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1大鼠腹膜間皮細胞的培養(yǎng)和鑒定 常規(guī)培養(yǎng)的大鼠腹膜間皮細胞生長至融合狀態(tài)后呈現(xiàn)多邊形、菱形、橢圓形，大小不等，具有典型的鵝卵石狀或鋪路石樣上皮細胞形態(tài)，抗大鼠角蛋白(Keratin)、波形蛋白(Vimentin)陽性，證實為腹膜間皮細胞見圖1。

圖1 大鼠腹膜間皮細胞的鑒定

2.2各組RPMCs VEGF及其受體mRNA表達 中糖組、高糖組VEGF、VEGFR1、sFlt-1 mRNA表達水平顯著高于低糖組、糊精組及對照組(均P<0.01)，低糖組與糊精組明顯高于對照組(均P<0.05)，低糖組與糊精組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。中糖組、高糖組VEGFR2 mRNA表達顯著低于低糖組、糊精組及對照組(均P<0.01)，低糖組與糊精組VEGFR2 mRNA表達低于對照組(P<0.05)，低糖組與糊精組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1，圖2。

圖2 各組RPMCs的VEGF、VEGFR1、sFlt-1和VEGFR2 mRNA表達

組別VEGF mRNAVEGFR1 mRNAsFlt-1 mRNAVEGFR2 mRNA對照組0.236±0.0191)0.118±0.0111)0.131±0.0121)1.234±0.1091)低糖組0.578±0.0231)2)0.203±0.0181)2)0.364±0.0321)2)0.882±0.0651)2)中糖組0.976±0.1100.685±0.0490.782±0.0510.276±0.019高糖組1.146±0.2140.981±0.0780.912±0.1160.193±0.012糊精組0.553±0.0421)2)0.211±0.0211)2)0.385±0.0141)2)0.891±0.0861)2)

與中糖及高糖組比較：1)P<0.01;與對照組比較：2)P<0.05

2.3各組RPMCs VEGF及其受體蛋白表達比較 Western印跡法結(jié)果顯示，中糖組、高糖組VEGFR1蛋白表達水平顯著高于低糖組、糊精組及對照組(均P<0.05)，低糖組與糊精組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；中糖組、高糖組VEGFR2蛋白表達顯著低于低糖組、糊精組及對照組(均P<0.01)，低糖組明顯低于對照組(P<0.01)；ELISA結(jié)果顯示，中糖組、高糖組VEGF、sFlt-1表達水平顯著高于對照組(P<0.05)，高糖組顯著高于低糖組及糊精組(P<0.05)，低糖組與糊精組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖3，表2。

圖3 各組RPMCs的VEGFR1和VEGFR2蛋白表達

組別VEGF(pg/ml)sFlt-1(pg/ml)VEGFR1VEGFR2對照組236.7±25.4113.1±27.30.142±0.0120.703±0.081低糖組325.3±30.2123.2±21.60.245±0.0270.452±0.0273)中糖組437.2±33.74)152.8±25.44)0.487±0.0321)4)0.211±0.0182)3)高糖組528.1±36.51)4)198.7±36.11)4)0.602±0.0461)4)0.122±0.0102)3)糊精組318.0±28.9121.9±19.90.250±0.0150.649±0.059

與低糖組及糊精組比較：1)P<0.05,2)P<0.01;與對照組比較：3)P<0.01,4)P<0.05

3 討 論

在腹膜透析過程中，腹腔長時間暴露于傳統(tǒng)的含糖腹膜透析液可引起腹膜功能改變、腹膜間皮細胞丟失、血管增生及腹膜纖維化，血管增生可導(dǎo)致腹膜有效表面積增大，溶質(zhì)轉(zhuǎn)運系數(shù)增加，最終導(dǎo)致超濾衰竭〔5〕。研究表明，腹腔局部VEGF的上調(diào)是其中心環(huán)節(jié)〔6，7〕。動物模型表明，高乳酸鹽濃度、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1、低pH等均可促使腹膜血管生成、VEGF合成增加。Bajo等〔8〕證實，用傳統(tǒng)的腹透液刺激腹膜間皮細胞后，E-鈣黏蛋白(cadherin)表達減少，細胞形態(tài)發(fā)生改變，VEGF表達增加，而接受低GDP腹透液刺激的細胞則無上述變化。VEGF家族成員包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E和胎盤生長因子(PLGF)，其中VEGF-A(通稱VEGF)是目前發(fā)現(xiàn)最為重要的血管生成正性調(diào)節(jié)因子，主要通過結(jié)合VEGFR1(Flt-1)和VEGFR2(Flk-1/KDR)發(fā)揮分子生物學(xué)效應(yīng)〔9，10〕，此外，F(xiàn)lt-1基因僅由選擇性剪切的6個Ig區(qū)域組成，與VEGF有很強的親和性。VEGF與受體結(jié)合后可迅速增加細胞內(nèi)Ca2+水平，通過磷酸肌醇特異性磷脂酶C途徑，使細胞內(nèi)IP3水平升高，促進新生血管生成、增加血管通透性。Io等〔11〕研究發(fā)現(xiàn)，腹膜組織中VEGF及VEGFR-1 mRNA表達增加，在第21和35 d達到高峰，與本文結(jié)果趨勢一致。Zhang等〔12〕在尿毒癥患者腹膜血管壁檢測出了VEGFR1和VEGFR2，且VEGFR2與腹膜微血管密度、小分子溶質(zhì)轉(zhuǎn)運速率及24 h腹膜蛋白排泄密切相關(guān)，提示VEGFR2可能是腹膜基線轉(zhuǎn)運特征的重要決定因子。與本研究結(jié)果不同，可能與體內(nèi)檢測的是腹膜組織總VEGFR2表達，而本研究僅檢測腹膜間皮細胞VEGFR2表達有關(guān)。此外，由于sFlt-1缺乏酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域，沒有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，當sFlt-1出現(xiàn)后與VEGFR1競爭PLGF、VEGF，與VEGFR2競爭VEGF，也是細胞接受刺激后VEGFR2下調(diào)的原因〔13〕。最近研究顯示，VEGF的高水平可預(yù)測患者的全因死亡率，升高的sFlt-1與炎癥因子可聯(lián)合增加患者全因死亡率的風(fēng)險；此外，sFlt-1同內(nèi)皮細胞損傷的標志物細胞間黏附分子(ICAM)-1、血管細胞黏附分子(VCAM)-1正相關(guān)，VEGF和sFlt-1同C反應(yīng)蛋白及白細胞計數(shù)相關(guān)〔14，15〕，提示VEGF及sFlt-1通過促使炎癥細胞趨化參與炎癥過程〔16〕，其潛在的病理生理學(xué)作用可能為在細胞激活過程中，使其更容易受到炎癥因子的攻擊，甚至同炎癥因子有協(xié)同作用〔17〕。糊精腹膜透析液含7.5%多聚葡萄糖，由谷物淀粉水解后產(chǎn)生，其85%分子量在16 800～45 000 D，只有6%分子量小于16 800 D。由于其分子量較大，不能通過腹膜上的小孔吸收，只能通過液體的對流緩慢吸收，故能長時間維持有效滲透壓濃度，在高轉(zhuǎn)運及高平均轉(zhuǎn)運患者能改善超濾〔4，18〕，且由于其滲透濃度低，較少形成糖基化終產(chǎn)物，故較dextrose生物相容性更好〔19〕，此外，有研究證實，糊精腹膜透析液能更好地保護殘余腎功能〔20〕。有文獻報道，7.5% icodextrin也會使腹膜間皮細胞增殖和活力下降，細胞內(nèi)活性氧增加，細胞功能下降，但和1.5% dextrose調(diào)節(jié)水平一致，且低于4.25% dextrose〔19〕，與本文結(jié)果趨勢基本一致。筆者推測，7.5% icodextrin對于VEGF系統(tǒng)的調(diào)節(jié)是其生物相容性較好的機制之一。綜上，腹膜透析液能顯著上調(diào)VEGF及其受體VEGFR1、sFlt-1的表達，下調(diào)VEGFR2的表達，以2.5% dextrose及4.25% dextrose 最為顯著，7.5% icodextrin對VEGF及其受體的調(diào)節(jié)水平低于2.5% dextrose及4.25% dextrose，從新的角度證實了icodextrin具有良好的生物相容性，但VEGF的受體在透析液刺激下發(fā)生上述變化的意義還待動物模型證實。