邵維斌，路 萍，夏春英，李 忻，荀 康

（鎮(zhèn)江市第一人民醫(yī)院腎臟內(nèi)科，江蘇 鎮(zhèn)江 212002）

晚期糖基化終產(chǎn)物對體外培養(yǎng)人腹膜間皮細(xì)胞上皮-間葉轉(zhuǎn)化的影響

邵維斌，路 萍，夏春英，李 忻，荀 康

（鎮(zhèn)江市第一人民醫(yī)院腎臟內(nèi)科，江蘇 鎮(zhèn)江 212002）

目的 建立晚期糖基化終產(chǎn)物（AGEs）誘導(dǎo)體外培養(yǎng)人腹膜間皮細(xì)胞上皮-間葉轉(zhuǎn)化（Epithelial-to- Mesenchymal Transition，EMT）的模型。方法 體外培養(yǎng)的人腹膜間皮細(xì)胞經(jīng)含40mM、80mM AGEs的M199培養(yǎng)基分別培養(yǎng)48、72小時(shí)；以正常M199培養(yǎng)基和含80mM BSA的M199培養(yǎng)基為對照。采用相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測mRNA的表達(dá)情況；運(yùn)用Western 印跡法檢測蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果 （1）AGEs刺激后人腹膜間皮細(xì)胞由典型的上皮細(xì)胞形態(tài)逐漸變?yōu)樗笮渭安灰?guī)則形，類似肌成纖維細(xì)胞；（2）AGEs刺激后，人腹膜間皮細(xì)胞膠原蛋白I（CollagenI）mRNA、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）mRNA和α-SMA蛋白表達(dá)水平顯著增加（P＜0.05）；（3）AGEs刺激后，人腹膜間皮細(xì)胞E-鈣粘蛋白（E-cadherin）mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著下降（P＜0.05）。結(jié)論 AGEs能上調(diào)體外培養(yǎng)人腹膜間皮細(xì)胞α-SMA、Collagen I表達(dá)和下調(diào)E-cadherin表達(dá)，AGEs誘導(dǎo)人腹膜間皮細(xì)胞EMT。

晚期糖基化終產(chǎn)物；間皮細(xì)胞；上皮-間葉轉(zhuǎn)化

長期腹膜透析患者，高濃度葡萄糖、晚期糖基化終產(chǎn)物等可引起腹膜間皮細(xì)胞發(fā)生EMT，導(dǎo)致腹膜會(huì)出現(xiàn)新生血管和纖維化等結(jié)構(gòu)改變，這些腹膜結(jié)構(gòu)改變是腹膜功能衰竭的主要原因[1，2]。為建立體外培養(yǎng)人腹膜間皮細(xì)胞EMT模型，我們設(shè)計(jì)了本研究。

1 材料與方法

1.1 原代人腹膜間皮細(xì)胞的培養(yǎng)

按文獻(xiàn)[3]進(jìn)行人腹膜間皮細(xì)胞體外培養(yǎng)、傳代及鑒定。

1.2 分組

（1）對照組，M199培養(yǎng)基；（2）BSA組，含80 m M牛血清白蛋白（BSA）的M199培養(yǎng)基，（3）40 m M AGEs組，含40 mM AGEs-BSA的M199培養(yǎng)基；（4）80 m M AGEs組，含80 mM AGEs-BSA的M199培養(yǎng)基；第3代人腹膜間皮細(xì)胞經(jīng)上述各組培養(yǎng)基分別培養(yǎng)48、72小時(shí)后收集細(xì)胞。

1.3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測

膠原蛋白I、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白、E-鈣粘蛋白mRNA 的表達(dá) 參照文獻(xiàn)[4-5]方法抽提細(xì)胞總RNA及運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒檢測mRNA的表達(dá)情況，按公式2-△△Ct求出E-cadherin、α-SMA、Collagen I mRNA表達(dá)的相對變化量。

1.4 Western 印跡法檢測E-鈣粘蛋白、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白的表達(dá)[4-5]

上述各組的人腹膜間皮細(xì)胞經(jīng)裂解、離心后，裂解蛋白經(jīng)凝膠電泳后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，脫脂奶粉封閉，分別加入E-cadherin抗體、α-SMA抗體和β-actin抗體4℃過夜，洗膜后加辣根過氧化酶標(biāo)記的人抗小鼠IgG抗體，洗膜后加ECL試劑，X線自顯影顯示結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用SAS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組間計(jì)量資料比較用方差分析，兩兩比較用Student-Newman-Keals 檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性定義為P＜0.05。

2 結(jié) 果

2.1 晚期糖基化終產(chǎn)物對體外培養(yǎng)人腹膜間皮細(xì)胞引起細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化的影響

在對照組及BSA組，體外培養(yǎng)人腹膜間皮細(xì)胞呈鋪路石狀，在40AGEs組和80AGEs組體外培養(yǎng)人腹膜間皮細(xì)胞48小時(shí)后人腹膜間皮細(xì)胞失去原來的鋪路石狀形態(tài)，逐漸拉長，72小時(shí)后細(xì)胞出現(xiàn)明顯的似成纖維細(xì)胞樣形態(tài)改變（呈梭形或不規(guī)則形、部分細(xì)胞出現(xiàn)互相交叉重疊）。

2.2 晚期糖基化終產(chǎn)物對人腹膜間皮細(xì)胞E-cadherin、α-SMA、Collagen I mRNA表達(dá)的影響

實(shí)時(shí)定量PCR檢測結(jié)果顯示，與對照組及BSA組相比，在40AGEs組和80AGEs組體外培養(yǎng)人腹膜間皮細(xì)胞48、72小時(shí)后，α-SMA mRNA、Collagen I mRNA表達(dá)水平顯著上升（P＜0.05）。見圖1、圖2。而E-cadherin mRNA表達(dá)水平顯著下降（P＜0.05）。見圖3。

2.3 晚期糖基化終產(chǎn)物對人腹膜間皮細(xì)胞E-cadherin、α-SMA蛋白表達(dá)的影響

Western印跡結(jié)果顯示，與對照組及BSA組相比，在40AGEs組和80AGEs組體外培養(yǎng)人腹膜間皮細(xì)胞48、72小時(shí)后，α-SMA蛋白表達(dá)水平顯著上升（P＜0.05）。見圖4。而E-cadherin 蛋白表達(dá)水平顯著下降（P＜0.05）。見圖5。

圖1 各組間皮細(xì)胞α-SMA mRNA的相對表達(dá)量

圖2 各組間皮細(xì)胞CollagenI mRNA的相對表達(dá)量

圖3 各組間皮細(xì)胞E-cadherin mRNA的相對表達(dá)量

圖4 各組間皮細(xì)胞α-SMA 蛋白的相對表達(dá)量

圖5 各組間皮細(xì)胞E-cadherin 蛋白的相對表達(dá)量

3 討 論

在我國，腹膜透析已成為越來越多終末期腎衰患者首選腎替代治療方式。然而隨著腹膜透析長期進(jìn)行，腹膜間皮細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)表型改變，發(fā)生EMT，參與腹膜出現(xiàn)新生血管形成及透明樣血管病變、纖維化等病理改變，從而導(dǎo)致腹膜功能衰竭。但目前對于腹膜間皮細(xì)胞膜EMT在腹膜纖維化和新生血管形成等腹膜病理改變過程中的作用和機(jī)制尚不完全清楚。

我們先前研究發(fā)現(xiàn)高濃度葡萄糖及晚期糖基化終產(chǎn)物能誘導(dǎo)大鼠腹膜間皮細(xì)胞EMT[4，5]，且晚期糖基化終產(chǎn)物能在蛋白和mRNA水平上上調(diào)體外培養(yǎng)大鼠腹膜間皮細(xì)胞TGF-β1、VEGF基因表達(dá)[5]，提示腹膜間皮細(xì)胞膜EMT可能在腹膜纖維化、新生血管形成等病理改變過程中起重要作用。我們的這些研究是以大鼠腹膜間皮細(xì)胞為模型進(jìn)行的，為了進(jìn)一步探討腹膜間皮細(xì)胞膜EMT在腹膜腹膜損傷過程中的作用和機(jī)制，需要建立人腹膜間皮細(xì)胞EMT體外模型。我們在本研究中發(fā)現(xiàn)：AGEs不僅能引起體外培養(yǎng)人腹膜間皮細(xì)胞形態(tài)改變，而且AGEs還能上調(diào)人腹膜間皮細(xì)胞α-SMA、Collagen I mRNA和α-SMA蛋白表達(dá)水平和下調(diào)人腹膜間皮細(xì)胞E-cadherin mRNA和蛋白表達(dá)水平，表明AGEs誘導(dǎo)了人腹膜間皮細(xì)胞上皮-間葉轉(zhuǎn)化。我們研究結(jié)果為進(jìn)一步探討腹膜透時(shí)腹膜損傷機(jī)制提供了體外模型及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

[1] Devuyst O,Margetts PJ,Topley N.The pathophysiology of the peritoneal membrane.J Am Soc Nephrol,2010,21:1077–1085

[2] Mehrotra R,Devuyst O,Davies SJ,et al. The Current State of Peritoneal Dialysis. J Am Soc Nephrol,2016,27:3238-3252

[3] 邵維斌,錢家麒.從網(wǎng)膜組織法培養(yǎng)人腹膜間皮細(xì)胞.腎臟病與透析腎移植雜志,2001,10:92-94

[4] 邵維斌,荀 康,李 忻,等.高濃度葡萄糖誘導(dǎo)人腹膜間皮細(xì)胞上皮-間葉轉(zhuǎn)化.實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志,2010,17:4-7.

[5] 邵維斌,彭淑娟,夏春英,等,晚期糖基化終產(chǎn)物能誘導(dǎo)大鼠腹膜間皮細(xì)胞上皮-間葉轉(zhuǎn)化.實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志,2011,19:6-9.

本文編輯：吳玲麗

Effects of advanced glycation end products on epithelial mesenchymal transition in cultured human peritoneal mesothelial cells

SHAO Wei-bin, LU Ping, XIA Chun-Ying, LI Xin, XUN Kang
(Department of Nephrology, The First People’s Hospital of Zhenjiang City, Jiangsu Zhenjiang 212002, China)

Objective To establish a Epithelial-to- Mesenchymal,Transition（EMT) model of human peritoneal mesothelial cells induced by advanced glycation end products (AGEs) in vitro. Methods The human peritoneal mesothelial cells were cultured for different time (48 hours and 72 hours) in culture medium containing different concentrations of Advanced glycation end products (40mM、80mM)，M199 meudim and medium with M199 meudim containing 80mM BSA as negative control,Then phenotype changes of human peritoneal mesothelial cells were observed by light microscopy;Then the expression of α-smooth muscle actin(α-SMA) mRNA,collagen I mRNA,E-cadherin mRNA was determined with real time fluorescence quantitative PCR; The protein levels of α-SMA and E-cadherin were determined with Western blotting. Results (1) Phenotype changes of human peritoneal mesothelial cells were observed in Advanced glycation end products group including loss of classic epithelial phenotype and acquirement the appearance similar to myofibroblast.(2)Compared with the control group,AGEs significantly upregulated the expression of Collagen I mRNA ,α-smooth muscle actin(α-SMA) mRNA and protein (P＜0.05),(3) Compared with the control group,AGEs significantly downregulated the E-cadherin mRNA and protein expression(P＜0.05) in the human peritoneal mesothelial cells. Conclution Advanced glycation end products can induce epithelial-to- mesenchymal transition of human peritoneal mesothelial cells，which is proved by downregulation of E-cadherin expression and upregulation of α-SMA and Collagen Iexpression .

Peritoneal mesothelial cells;Epithelial-to-mesenchymal transition;Advanced glycation end products

R459.5

A

ISSN.2095-8242.2017.32.6147.03

鎮(zhèn)江市科技項(xiàng)目（SH2013051）

邵維斌（1967-），男，江蘇如東人，主任醫(yī)師