李蕊秀 趙昍朋 劉婧 吳家棟 何瑞平 岳鑫 張傳領(lǐng) 肖瑞

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)1內(nèi)蒙古自治區(qū)分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2藥學(xué)院（呼和浩特010059）

不孕不育是一個(gè)嚴(yán)峻的問(wèn)題，受到社會(huì)廣泛關(guān)注。據(jù)統(tǒng)計(jì)，15%的育齡夫婦都受此問(wèn)題困擾，這其中約有50%的不孕不育因素與男性有關(guān)［1］。男性不育癥是一種由多因素引起的疾病，臨床表現(xiàn)一般為精液中精子密度低以及由于精子發(fā)生異常導(dǎo)致精液中無(wú)精子細(xì)胞存在［2］。精子發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，它依賴并受控于睪丸中存在的多種類型的生殖細(xì)胞。睪丸支持細(xì)胞、睪丸間質(zhì)細(xì)胞以及發(fā)育中的生殖細(xì)胞密切合作，保證精子發(fā)生正常運(yùn)行，產(chǎn)生成熟的精子使卵母細(xì)胞受精［3］。

二甲雙胍屬于胰島素增敏劑，是供給2型糖尿病患者一線口服治療的人工合成制劑［4］。由于其降糖作用明顯且副作用較小，目前已在臨床上應(yīng)用超過(guò)50年，現(xiàn)在全世界范圍內(nèi)每天有超過(guò)1億的糖尿病患者在服用二甲雙胍［5］。最近幾年，人們發(fā)現(xiàn)二甲雙胍還有很多其他作用。例如，KATO等［6］稱二甲雙胍可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖能力；CREANGA等［7］發(fā)現(xiàn)二甲雙胍聯(lián)合克羅米芬可通過(guò)誘導(dǎo)排卵改善多囊卵巢綜合征婦女的生育能力；BERTOLDO等［8］指出二甲雙胍不僅具有降血糖作用，它還可以作用于包括生殖系統(tǒng)在內(nèi)的多種人體組織。

對(duì)于糖尿病男性患者來(lái)說(shuō)，睪丸組織的氧化損傷以及雄激素分泌障礙可能會(huì)不可逆地影響精子發(fā)生，進(jìn)而導(dǎo)致精子質(zhì)量下降，并直接或間接導(dǎo)致男性不育［9］。目前有關(guān)二甲雙胍與男性生殖的相關(guān)研究很少。因此，有必要去研究二甲雙胍對(duì)男性生殖系統(tǒng)的影響，評(píng)估其潛在的有害或有益的價(jià)值。本研究利用體外培養(yǎng)的TM3細(xì)胞，研究二甲雙胍對(duì)細(xì)胞增殖、周期和凋亡的影響，以及相關(guān)的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑甲福明鹽酸鹽（二甲雙胍）購(gòu)自Sigma公司，噻唑蘭（MTT）購(gòu)自北京chembase科技有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自北京TransGen生物技術(shù)有限公司，熒光定量試劑盒購(gòu)自北京TransGen生物技術(shù)有限公司，SDS?PAGE凝膠試劑盒購(gòu)自江蘇Beyotime生物技術(shù)研究所，Annexin V?FITC/PI凋亡試劑盒購(gòu)自BD公司，馬血清購(gòu)自HyClone公司，DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司。小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞（TM3）購(gòu)于上海中科院細(xì)胞庫(kù)。

1.2 MTT法檢測(cè)二甲雙胍對(duì)TM3細(xì)胞體外增殖的影響常規(guī)消化法收集處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的TM3細(xì)胞沉淀并計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度后使96孔板中每孔接種的細(xì)胞數(shù)約為1×104個(gè)/孔。次日待細(xì)胞貼壁依次分別加入含有不同濃度二甲雙胍（0、2.5、5、7.5、10 mmol/L）的培養(yǎng)基，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，待三張孔板分別在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72 h后，避光條件下每孔加入20μL MTT孵育4 h后棄去上清，每孔加入150μL DMSO，置于震蕩器上避光低速振蕩10 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在490 nm波長(zhǎng)處的吸光度并計(jì)算細(xì)胞抑制率：細(xì)胞抑制率（%）=［（對(duì)照孔OD值-實(shí)驗(yàn)孔OD值）/（對(duì)照孔OD值-空白孔OD值）］×100%。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)二甲雙胍對(duì)細(xì)胞凋亡的影響將TM3細(xì)胞用常規(guī)消化法收集，按細(xì)胞數(shù)為2×105個(gè)/孔接種于6孔板中。次日按照半抑制濃度6.7 mmol/L加入二甲雙胍配制成實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組各孔分別加入各自的培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞沉淀用預(yù)冷PBS洗滌。按照調(diào)亡試劑盒的說(shuō)明向每管加入相應(yīng)比例1×Binding buffer、Annexin V?FITC、PI并振蕩混勻，室溫下避光孵育15 min。1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，計(jì)算活細(xì)胞、早/晚期調(diào)亡細(xì)胞的百分率。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)二甲雙胍對(duì)細(xì)胞周期的影響常規(guī)消化法收集TM3細(xì)胞，按細(xì)胞數(shù)為2×105個(gè)/孔接種于6孔板中。待細(xì)胞貼壁棄去原培養(yǎng)基，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組各孔分別加入各自的培養(yǎng)基繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞沉淀。用預(yù)冷的PBS洗滌并重懸細(xì)胞，加入70%乙醇4℃固定過(guò)夜。次日棄去固定液并用預(yù)冷的PBS洗滌，加入0.5 mL PI/RNase Staining Buffer重懸細(xì)胞，經(jīng)200目濾網(wǎng)過(guò)濾后，在室溫下避光孵育15 min；1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，用Modifit軟件分析各細(xì)胞周期的比例。

1.5 細(xì)胞RNA提取和熒光定量PCRTrizol法提取TM3細(xì)胞總RNA，以1 000 ng總RNA按反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。將反轉(zhuǎn)錄后的cDNA作為模板，依照TransGen熒光定量試劑盒說(shuō)明書，用7500 fast熒光定量PCR儀（美國(guó)AB公司）進(jìn)行檢測(cè)。反應(yīng)體系：TransStart Top Green qPCR SuperMix（2×）10μL，Passive Reference DyeⅡ（50×）0.4μL，ddH2O 6.8μL，上下游引物各0.4μL，cDNA 2μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。PCR引物見(jiàn)表1，以GAPDH作為內(nèi)參。用2-△△CT法分析結(jié)果。

1.6 Western blot細(xì)胞總蛋白提取后，用BCA定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。調(diào)整濃度為20 ng，按1∶1的比例加入2×SDS上樣緩沖液，95℃5 min后立即冰浴，10%SDS?PAGE凝膠上樣 20 μL，常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂牛奶封閉，一抗（AMPK：1∶2 000、P?AMPK 1∶1 000、α?tubulin 1∶2 000），搖勻儀上4℃孵育過(guò)夜。室溫孵育與一抗相對(duì)應(yīng)的二抗（辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG 1∶2 000稀釋）1 h，TBST洗滌2次，每次15 min；最后1次用TBS洗滌10 min。取出NC膜，在避光條件下將其置于Odessey CLX紅外激光成像系統(tǒng)，掃描并觀察結(jié)果。

表1 基因引物信息Tab.1 Gene primer information

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)以s表示，采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，兩組樣本均數(shù)比較行t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測(cè)二甲雙胍對(duì)TM3細(xì)胞體外增殖能力的影響TM3細(xì)胞經(jīng)不同濃度的二甲雙胍（2.5、5、7.5、10 mmol/L）干預(yù)48 h后，細(xì)胞活性分別為81.68±1.54、64.19±1.62、46.45±2.02、37.90±2.03（圖1A）。由此得知隨著二甲雙胍的作用濃度逐漸增加，TM3細(xì)胞的細(xì)胞活性也逐漸降低。此外，還在不同時(shí)間點(diǎn)（24、48、72 h）研究了二甲雙胍對(duì)TM3細(xì)胞增殖的作用。發(fā)現(xiàn)隨著藥物作用濃度逐漸增加和藥物作用時(shí)間逐漸延長(zhǎng)，二甲雙胍對(duì)TM3細(xì)胞增殖的抑制作用亦逐漸增加，表現(xiàn)為濃度依賴性和時(shí)間依賴性（圖1B）。

圖1 MTT檢測(cè)結(jié)果Fig.1 MTTassay results

2.2 二甲雙胍對(duì)TM3細(xì)胞凋亡的影響二甲雙胍可顯著抑制TM3細(xì)胞的增殖，細(xì)胞增殖的抑制是否通過(guò)凋亡途徑發(fā)生？采用流式細(xì)胞術(shù)的方法檢測(cè)TM3細(xì)胞經(jīng)過(guò)二甲雙胍處理后的凋亡情況。實(shí)驗(yàn)組給予半抑制濃度6.7 mmol/L的二甲雙胍，48 h后將實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞收集并進(jìn)行Annexin V?FITC/PI染色來(lái)標(biāo)記細(xì)胞的凋亡情況。發(fā)現(xiàn)二甲雙胍并未誘導(dǎo)TM3細(xì)胞發(fā)生明顯的調(diào)亡（圖2A、B）；二甲雙胍對(duì)該細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)率為（9.34±0.71）%，與對(duì)照組細(xì)胞（8.77±0.25）%相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖2C）。對(duì)此，在蛋白水平上也進(jìn)行了驗(yàn)證，眾所周知caspase?3的激活是細(xì)胞凋亡的重要標(biāo)志。將TM3細(xì)胞經(jīng)二甲雙胍干預(yù)48 h后提取蛋白做Western blot，以乳腺癌細(xì)胞MDA?MB?231做陽(yáng)性對(duì)照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TM3細(xì)胞未見(jiàn)表達(dá)，而陽(yáng)性對(duì)照乳腺癌細(xì)胞有表達(dá)（圖2D）。

圖2 二甲雙胍干預(yù)后TM3細(xì)胞調(diào)亡的結(jié)果Fig.2 Apoptosis of TM3 cells after metformin intervention

2.3 二甲雙胍對(duì)TM3細(xì)胞周期的影響采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)二甲雙胍對(duì)TM3細(xì)胞周期的影響。發(fā)現(xiàn)TM3細(xì)胞經(jīng)6.7 mmol/L二甲雙胍干預(yù)48 h后，實(shí)驗(yàn)組G2/M期細(xì)胞所占比例顯著高于對(duì)照組（圖3A、B）。同樣TM3細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的G2/M期細(xì)胞所占比例亦差異極顯著（圖3C）隨后，通過(guò)熒光定量PCR方法檢測(cè)了TM3細(xì)胞經(jīng)過(guò)二甲雙胍干預(yù)后調(diào)控細(xì)胞周期蛋白cyclin D1和cyclin B1的情況。用半抑制濃度6.7 mmol/L的二甲雙胍處理該細(xì)胞48 h后，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組cyclin D1和cyclin B1的表達(dá)下調(diào)（P＜0.05，圖3D）。

2.4 二甲雙胍激活TM3細(xì)胞AMPK信號(hào)通路Western blot方法檢測(cè)二甲雙胍是否可以激活TM3細(xì)胞中的AMPK信號(hào)通路從而引起細(xì)胞增殖的抑制和周期的阻滯。將TM3細(xì)胞用半抑制濃度6.7 mmol/L的二甲雙胍處理，48 h后提蛋白，以α?tubulin作為內(nèi)參蛋白，結(jié)果顯示TM3細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組的磷酸化的AMPKα（Thr172）與對(duì)照組相比略有升高，而未磷酸化的AMPK的表達(dá)相應(yīng)的下降（圖4）。

3 討論

二甲雙胍（1，1--二甲基雙胍鹽酸鹽）作為一種治療糖尿病的有效藥物，可提高胰島素的敏感性并降低空腹胰島素水平［10］。過(guò)去幾年里，人們發(fā)現(xiàn)二甲雙胍還有很多其他作用。例如，有報(bào)道稱，二甲雙胍可抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖［11-12］，其與卡鉑合用增加卵巢癌的化療效果［13］。也有報(bào)道稱，這種藥物會(huì)降低糖尿病婦女乳腺癌的發(fā)病率［14］。同時(shí)，二甲雙胍已被應(yīng)用于女性多囊卵巢綜合征的治療，誘導(dǎo)排卵并提高妊娠率［7］。ADARAMOYE等［15］對(duì)成年雄性大鼠采用連續(xù)21d灌注二甲雙胍，結(jié)果顯示大鼠睪丸內(nèi)的精子數(shù)量與精子活力明顯下降。此外，還表現(xiàn)為睪丸組織損傷和睪丸功能障礙，并發(fā)睪丸脂質(zhì)過(guò)氧化。這表明在二甲雙胍干預(yù)下的動(dòng)物體內(nèi)，成熟精子的生成受到嚴(yán)重影響。

圖3 二甲雙胍對(duì)TM3細(xì)胞周期的影響結(jié)果Fig.3 Effect of metformin on cell cycle of TM3

圖4 Western blot檢測(cè)TM3細(xì)胞AMPK和p?AMPKα（Thr172）的表達(dá)情況Fig.4 Western blot detection of TM3 cells AMPK and p?AMPKα（Thr172）expression

關(guān)于二甲雙胍對(duì)男性生殖細(xì)胞增殖和凋亡的體外實(shí)驗(yàn)，目前僅有FAURE等［16］進(jìn)行了一項(xiàng)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，研究二甲雙胍對(duì)公雞睪丸支持細(xì)胞的影響，他們發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍抑制了公雞睪丸支持細(xì)胞的增殖，但并未誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，且細(xì)胞的形態(tài)亦沒(méi)有改變。本研究選擇小鼠睪丸支持細(xì)胞作為體外實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象，采用不同濃度二甲雙胍分別干預(yù)，結(jié)果表明二甲雙胍對(duì)TM3細(xì)胞的體外增殖有抑制作用，并表現(xiàn)為濃度依賴性和時(shí)間依賴性。采用IC50作用濃度的二甲雙胍并沒(méi)有誘導(dǎo)TM3細(xì)胞發(fā)生明顯的凋亡，由此推測(cè)二甲雙胍對(duì)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞增殖的抑制可能是通過(guò)其他機(jī)制來(lái)實(shí)現(xiàn)的。細(xì)胞周期的順利運(yùn)行是細(xì)胞增殖的關(guān)鍵，本研究釆用流式細(xì)胞儀檢測(cè)二甲雙胍對(duì)TM3細(xì)胞周期的影響，發(fā)現(xiàn)二甲雙胍干預(yù)后處于G0/G1期的TM3細(xì)胞所占比例顯著減少，而處于G2/M期的細(xì)胞比例顯著增多。同時(shí)，還進(jìn)行了實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示二甲雙胍干預(yù)可下調(diào)該細(xì)胞cyclin B1及cyclin D1 mRNA的表達(dá)。說(shuō)明調(diào)控細(xì)胞周期關(guān)鍵蛋白并使細(xì)胞周期阻滯在G2/M期可能是二甲雙胍抑制TM3細(xì)胞增殖的重要機(jī)制。有研究［17-18］顯示AMPK通路可能調(diào)控睪丸支持細(xì)胞的功能。Western blot結(jié)果說(shuō)明二甲雙胍能夠激活TM3細(xì)胞中的AMPK信號(hào)通路，通過(guò)該通路影響睪丸細(xì)胞的生殖和發(fā)育。

綜上所述，本次研究發(fā)現(xiàn)了二甲雙胍具有抑制生殖細(xì)胞的體外增殖能力，這種抑制作用可能是通過(guò)誘導(dǎo)生殖細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，并且激活A(yù)MPK通路實(shí)現(xiàn)的。然而，目前關(guān)于二甲雙胍作用于男性生殖系統(tǒng)的確切機(jī)制還不完全清楚，有待未來(lái)繼續(xù)研究，希望這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以為以后研究二甲雙胍與男性生殖提供一些理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。