張靜　 王景　 王晉

摘 要：目的： 拓?fù)涮婵祵?duì)早幼粒白血病細(xì)胞增殖凋亡的影響；方法： 應(yīng)用四甲基偶氮唑鹽（MTT）光吸收法分別檢測(cè)0.1?mol/L、0.2?mol/L、0.4?mol/L、0.8?mol/L的TPT分別作用于HL-60細(xì)胞后12小時(shí)、24小時(shí)、36小時(shí)、48小時(shí)細(xì)胞增殖情況，計(jì)算增殖抑制率。結(jié)果：采用MTT法檢測(cè)在同一濃度TPT在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)HL-60細(xì)胞的抑制作用隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，與對(duì)照組相比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：拓?fù)涮婵祵?duì)HL-60細(xì)胞具有增殖抑制作用。

關(guān)鍵詞：拓?fù)涮婵?細(xì)胞增殖 凋亡

中圖分類號(hào)：R9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1003-9082（2018）07-0-02

拓?fù)涮婵担═PT）以DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ為作用靶點(diǎn)的半合成喜樹堿衍生物，是一種新藥，呈水溶性，目前已廣泛應(yīng)用于多種實(shí)體瘤的治療及試用于惡性血液系統(tǒng)疾病的治療[1]，并取得較好療效。白血病是血液系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，近年來(lái)發(fā)病率越來(lái)越高，死亡率也很高[2]，這就嚴(yán)重影響了國(guó)民健康。但是隨著聯(lián)合化療的不斷發(fā)展，骨髓移植術(shù)的不斷提高，免疫治療及基因治療的不斷改善[3]，急性白血病的治療效果明顯得到了很大的提高。

一、材料與方法

1.材料

1.1細(xì)胞株

人源性白血病細(xì)胞系HL-60細(xì)胞，由中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

TPT（注射用鹽酸拓?fù)涮婵担核募厩嘤邢薰尽?/p>

2.方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)

采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基在37℃、5%CO2飽和濕度下的恒溫箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，平均2-3天換液一次，細(xì)胞生長(zhǎng)良好，取倍增期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2實(shí)驗(yàn)分組

2.2.1細(xì)胞培養(yǎng)

選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好、在倍增期的HL-60細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組，共分為兩組：對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組不加用任何濃度的拓?fù)涮婵担瑢?shí)驗(yàn)組分別加用0.1?mol/L、0.2?mol/L、0.4?mol/L及0.8?mol/L濃度的拓?fù)涮婵?，選取作用時(shí)間為12h、24h、36h和48h。

2.2.2四甲基偶氮唑鹽光吸收法

用新鮮配制RPMI1640培養(yǎng)基把細(xì)胞配制成單個(gè)細(xì)胞懸液，在96孔培養(yǎng)板中接種，每孔5×104個(gè)細(xì)胞200?l量，并設(shè)置平行孔。

向?qū)嶒?yàn)組中分解加入0.1?mol/L、0.2?mol/L、0.4?mol/L、0.8?mol/L的拓?fù)涮婵?，在?duì)照組應(yīng)加入同等量的生理鹽水。加藥后經(jīng)過(guò)12h、24h、36h、48h分別作用后，每孔加入20?l的MTT溶液，不棄去培養(yǎng)基的條件下，放入37℃和5%CO2孵育箱內(nèi)孵育4小時(shí)，等待檢測(cè)。將每組每孔細(xì)胞均勻輕輕細(xì)細(xì)吹打，混勻，移入1.5mlEP管中，離心，再在每孔中加入二甲基亞砜150?l，輕輕搖蕩10min，使其完全得到溶解。然后將混合液再次置入96孔板中，將96孔板放入酶標(biāo)儀中，選擇波長(zhǎng)490nm處，檢測(cè)各孔的光吸收值，記錄結(jié)果并把結(jié)果打印。根據(jù)該結(jié)果計(jì)算增殖抑制率，抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組值/對(duì)照組值）×100%來(lái)實(shí)現(xiàn)的，根據(jù)增殖抑制率的結(jié)果得出細(xì)胞的最適作用濃度和最適作用時(shí)間。

二、結(jié)果

不同濃度的TPT在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)HL60細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的MTT結(jié)果。

分別采用0.1?mol/L、0.2?mol/L、0.4?mol/L、0.8?mol/L的TPT研究在不同時(shí)間點(diǎn)（12h、24h、36h、48h）對(duì)HL-60細(xì)胞的抑制作用，MTT結(jié)果顯示各濃度值的抑制細(xì)胞增殖作用均隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，各組與對(duì)照組相比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。同一濃度TPT在不同時(shí)間點(diǎn)抑制率兩兩比較，除36h和48h兩時(shí)間點(diǎn)的抑制率比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外（P>0.05），余各時(shí)間點(diǎn)對(duì)HL-60細(xì)胞的抑制率均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

同一時(shí)間點(diǎn)不同濃度的TPT（0.1?mol/L、0.2?mol/L、0.4?mol/L、0.8?mol/L）對(duì)HL-60細(xì)胞的增殖抑制作用隨著濃度增高而增強(qiáng)，各組與對(duì)照組相比較（P>0.05），各濃度組均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；進(jìn)一步對(duì)同一時(shí)間不同濃度組兩兩之間比較，除0.4?mol/L與0.8?mol/L藥物濃度組在同一時(shí)間點(diǎn)抑制率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）外，余各濃度組在同一時(shí)間點(diǎn)不同濃度兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

由上述可見(jiàn)，TPT對(duì)HL-60細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制作用，其抑制作用具有劑量依賴性和時(shí)間依賴性，其作用的最佳時(shí)間和最適濃度分別為36h和0.4?mol/L（見(jiàn)表1）。后續(xù)試驗(yàn)均采用0.4?mol/LTPT作用36h的HL-60細(xì)胞。

三、討論

拓?fù)涮婵担═PT）是1996年在美國(guó)上市的半合成抗腫瘤新藥，在臨床上已開始使用，它的臨床作用機(jī)制和其它喜樹堿藥物是相似的，因此具有喜樹堿類藥物共同的藥理作用，它是細(xì)胞內(nèi)一種特異性的拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ抑制劑已被確定。

近年來(lái)，隨著分子診斷學(xué)、分子藥理學(xué)和分子腫瘤學(xué)共同的迅猛發(fā)展，各種醫(yī)學(xué)技術(shù)的提高，也促使在白血病等惡性血液病的治療方面也已進(jìn)入到綜合治療時(shí)代，但最基礎(chǔ)最主要的治療方法仍然是化療，綜合治療手段包括聯(lián)合化療和免疫治療，也包含基因治療和造血干細(xì)胞移植治療等相關(guān)治療手段。DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶（topoisomerase）是一種對(duì)核酸空間結(jié)構(gòu) 實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)進(jìn)行調(diào)節(jié)的一種關(guān)鍵酶，拓?fù)洚悩?gòu)酶能夠?qū)怂嵘砉δ苡兄鲗?dǎo)作用，有Ⅰ型拓?fù)洚悩?gòu)酶（ Topo Ⅰ） 和Ⅱ型拓?fù)洚悩?gòu)酶（ Topo Ⅱ） 兩種類型。所表現(xiàn)出來(lái)的生物學(xué)作用主要通過(guò)下述方式來(lái)體現(xiàn)，一：調(diào)節(jié)控制DNA的超螺旋狀態(tài)，使其不斷進(jìn)行變化，并且控制DNA打結(jié)，控制DNA解結(jié)，使這兩種環(huán)鏈體狀態(tài)也發(fā)生不斷變化，進(jìn)而不直接地影響波及細(xì)胞內(nèi)核酸代謝過(guò)程，導(dǎo)致細(xì)胞代謝過(guò)程紊亂。二：不間接參和核糖核酸的重組、修復(fù)、轉(zhuǎn)錄等基因的合成過(guò)程，還直接加入核糖核酸的復(fù)制過(guò)程。DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ（Topo Ⅰ）是一種單亞基蛋白，位于20號(hào)染色體上，分子量為100kD，它參與DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、重組和修復(fù)等所有關(guān)鍵的過(guò)程[4]，是生物體內(nèi)及其重要的細(xì)胞核內(nèi)酶。研究顯示[5]TopoⅠ在非異常的組織中其含量穩(wěn)定不變，即使是細(xì)胞正處于增殖期時(shí)候，Topo Ⅰ也會(huì)保持在靜止期的兩倍的范圍之內(nèi)，但在惡性腫瘤組織中，Topo Ⅰ含量顯著上升?；谏鲜鲈恚霈F(xiàn)了很多以Topo Ⅰ為靶點(diǎn)的與Topo Ⅰ抑制劑相關(guān)的藥物，現(xiàn)已將這些藥物運(yùn)用到治療小細(xì)胞肺癌、卵巢癌等實(shí)體惡性腫瘤中，當(dāng)然還有惡性血液病上，臨床療效也被證實(shí)療效不錯(cuò)。近年來(lái)，已被很多學(xué)者公認(rèn)為喜樹堿衍生物和紫杉醇和維甲酸類化合物這三樣藥物，具有時(shí)代標(biāo)志意義，三者共同被稱為了20世紀(jì)90年代抵抗惡性腫瘤藥物的三大標(biāo)志性發(fā)現(xiàn)[6]。在美國(guó)國(guó)立癌癥研究所（NCI）中，藥物機(jī)制分析電腦網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)存在有被稱為所謂的六大抗腫瘤藥物，其中Topo Ⅰ抑制劑就是六大抗腫瘤藥物的其中之一，被列入各國(guó)重點(diǎn)藥物研究。如何從天然產(chǎn)物（植物、海洋生物等）中尋找新的化學(xué)結(jié)構(gòu)、克服耐藥性及不良反應(yīng)是新的細(xì)胞毒類抗腫瘤藥的發(fā)展目標(biāo)。

該研究觀察了顯微鏡下細(xì)胞所發(fā)生的形態(tài)學(xué)變化，檢測(cè)了利用MTT法得到的對(duì)細(xì)胞的增殖抑制率，（表一）本研究通過(guò)MTT法探討了拓?fù)涮婵祵?duì)HL-60細(xì)胞的增殖抑制的時(shí)間和濃度方面進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。檢測(cè)所得的數(shù)據(jù)顯示：同一時(shí)間點(diǎn)不同濃度的TPT對(duì)HL-60細(xì)胞的抑制作用，隨著濃度的升高，拓?fù)涮婵档囊种谱饔蔑@得越來(lái)增強(qiáng)，與對(duì)照組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異均達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)（P<0.05）。

在細(xì)胞周期中，拓?fù)涮婵涤贒NA復(fù)制前期就特異性地與DNA單鏈斷端上的拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ發(fā)生特異性結(jié)合，阻止了拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ修復(fù)單鏈斷端，破壞DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。拓?fù)涮婵稻哂袕V譜抗腫瘤活性[7]，在治療非霍淋巴瘤、腸癌、肺癌和卵巢癌等各種惡性腫瘤中，拓?fù)涮婵狄扬@示出了有較好的療效。

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