劉芳怡　李麗娟

摘 要：目的： 拓?fù)涮婵祵?duì)HL-60白血病細(xì)胞增殖凋亡的作用；方法： 應(yīng)用 MTT光吸收法分別檢測(cè)0.1?mol/L、0.2?mol/L、0.4?mol/L、0.8?mol/L的TPT分別作用于HL-60細(xì)胞后12小時(shí)、24小時(shí)、36小時(shí)、48小時(shí)細(xì)胞增殖情況，計(jì)算增殖抑制率，畫(huà)出生長(zhǎng)曲線反映拓TPT對(duì)HL-60白血病細(xì)胞增殖作用的影響。結(jié)果：采用MTT法檢測(cè)在同一濃度TPT在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)HL-60細(xì)胞的抑制作用隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)。結(jié)論：拓?fù)涮婵祵?duì)HL-60細(xì)胞具有增殖抑制作用。

關(guān)鍵詞：TPT 細(xì)胞增殖 凋亡

中圖分類號(hào)：R733.7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1003-9082（2018）06-0-02

拓?fù)涮婵担═PT）是一種拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑，作用位點(diǎn)比較獨(dú)特，拓?fù)洚悩?gòu)酶是一種細(xì)胞核內(nèi)酶，無(wú)多藥耐藥現(xiàn)象，有較好的選擇性特點(diǎn)。急性白血病 （acute leukemia）是一種惡性血液系統(tǒng)疾病，特點(diǎn)是造血干細(xì)胞功能大部分喪失，幼稚細(xì)胞不斷克隆，白血病患者的造血干細(xì)胞和正常的造血干細(xì)胞存在類似似的特點(diǎn)。白血病是血液系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，近年來(lái)發(fā)病率越來(lái)越高，死亡率也很高，這就嚴(yán)重影響了國(guó)民健康。

一、材料與方法

1.材 料

1.1細(xì)胞株

人源性白血病細(xì)胞系HL-60細(xì)胞，由中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所提供。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物

TPT（注射用鹽酸拓?fù)涮婵担核募厩嘤邢薰尽?/p>

2.方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)

采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基在37℃、5%CO2飽和濕度下的恒溫箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，平均2-3天換液一次，細(xì)胞生長(zhǎng)良好，取倍增期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2實(shí)驗(yàn)分組

選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好、在倍增期的HL-60細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組，共分為兩組：對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組不加用任何濃度的拓?fù)涮婵?，?shí)驗(yàn)組分別加用0.1?mol/L、0.2?mol/L、0.4?mol/L及0.8?mol/L濃度的拓?fù)涮婵?，選取作用時(shí)間為12h、24h、36h和48h。

2.3TPT對(duì)HL-60細(xì)胞增殖抑制作用的檢測(cè)

2.3.1TPT作用前后細(xì)胞的改變

加入拓?fù)涮婵登霸诘怪蔑@微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)及特性，并照相；同理加入拓?fù)涮婵岛笠灿陲@微鏡下觀察HL-60細(xì)胞所發(fā)生形態(tài)變化，并照相。

2.3.2四甲基偶氮唑鹽光吸收法

用新鮮配制RPMI1640培養(yǎng)基把細(xì)胞配制成單個(gè)細(xì)胞懸液，在96孔培養(yǎng)板中接種，每孔5×104個(gè)細(xì)胞200?l量，并設(shè)置平行孔。

向?qū)嶒?yàn)組中分解加入0.1?mol/L、0.2?mol/L、0.4?mol/L、0.8?mol/L的拓?fù)涮婵担趯?duì)照組應(yīng)加入同等量的生理鹽水。加藥后經(jīng)過(guò)12h、24h、36h、48h分別作用后，每孔加入20?l的MTT溶液，不棄去培養(yǎng)基的條件下，放入37℃和5%CO2孵育箱內(nèi)孵育4小時(shí)，等待檢測(cè)。將每組每孔細(xì)胞均勻輕輕細(xì)細(xì)吹打，混勻，移入1.5mlEP管中，離心，再在每孔中加入二甲基亞砜150?l，輕輕搖蕩10min，使其完全得到溶解。然后將混合液再次置入96孔板中，將96孔板放入酶標(biāo)儀中，選擇波長(zhǎng)490nm處，檢測(cè)各孔的光吸收值，記錄結(jié)果并把結(jié)果打印。根據(jù)該結(jié)果計(jì)算增殖抑制率，抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組值/對(duì)照組值）×100%來(lái)實(shí)現(xiàn)的，根據(jù)增殖抑制率的結(jié)果得出細(xì)胞的最適作用濃度和最適作用時(shí)間。

二、結(jié)果

不同濃度的TPT在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)HL60細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的MTT結(jié)果。

分別采用0.1?mol/L、0.2?mol/L、0.4?mol/L、0.8?mol/L的TPT研究在不同時(shí)間點(diǎn)（12h、24h、36h、48h）對(duì)HL-60細(xì)胞的抑制作用，MTT結(jié)果顯示各濃度值的抑制細(xì)胞增殖作用均隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)。

三、討論

近年來(lái)，隨著分子診斷學(xué)、分子藥理學(xué)和分子腫瘤學(xué)共同的迅猛發(fā)展，各種醫(yī)學(xué)技術(shù)的提高，也促使在白血病[1]等惡性血液病的治療方面也已進(jìn)入到綜合治療時(shí)代，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，拓?fù)涮婵悼鼓[瘤活性表現(xiàn)在對(duì)急性T淋巴母細(xì)胞白血病JM細(xì)胞株、乳腺癌細(xì)胞株[2，3]和動(dòng)物移植性模型轉(zhuǎn)接腫瘤的治療方面[4]。

拓?fù)涮婵颠@種新型的抗腫瘤藥物，現(xiàn)已廣泛推廣使用在臨床，它的臨床作用機(jī)制和其它喜樹(shù)堿藥物是相似的，因此具有喜樹(shù)堿類藥物共同的藥理作用，它是細(xì)胞內(nèi)一種特異性的拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ抑制劑已被確定。在細(xì)胞周期中，拓?fù)涮婵涤贒NA復(fù)制前期就特異性地與DNA單鏈斷端上的拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ發(fā)生特異性結(jié)合，阻止了拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ修復(fù)單鏈斷端，破壞DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。拓?fù)涮婵稻哂袕V譜抗腫瘤活性[5，6]，在治療非霍淋巴瘤、腸癌、肺癌和卵巢癌[7，8]等各種惡性腫瘤中，拓?fù)涮婵狄扬@示出了有較好的療效。在白血病細(xì)胞中，我們不難發(fā)現(xiàn)，拓?fù)涮婵蛋忻?Topo-Ⅰ要比正常血液細(xì)胞中的含量高出來(lái)很多，我們還發(fā)現(xiàn)，拓?fù)涮婵蹬c柔紅霉素、氨甲蝶呤、長(zhǎng)春新堿等化療藥物[9]沒(méi)有報(bào)道稱發(fā)生過(guò)交叉耐藥現(xiàn)象，這就提示我們拓?fù)涮婵捣浅？赡茉谥委熌退幍哪[瘤細(xì)胞方面顯示較好的療效，這就不難得出結(jié)論，也有很多報(bào)道證實(shí)了拓?fù)涮婵翟陔y治性白血病和急性早幼粒白血病的臨床治療方面療效好，同時(shí)療效佳在治療急性白血病、骨髓增生異常綜合征（MDS）和慢性粒細(xì)胞白血?。–MML）等臨床治療方面療效也有體現(xiàn)[10，11]。也有體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，拓?fù)涮婵悼鼓[瘤活性表現(xiàn)在對(duì)急性T淋巴母細(xì)胞白血病JM細(xì)胞株、乳腺癌細(xì)胞株[12，13]和動(dòng)物移植性模型轉(zhuǎn)接腫瘤的治療方面[14，15]?；A(chǔ)研究也表明，拓?fù)涮婵祵?duì)多種移植性鼠、人腫瘤有效，有學(xué)者專門(mén)對(duì)耐藥的HT-29人結(jié)腸癌細(xì)胞株的拓?fù)涮婵邓幬镏委熯M(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)拓?fù)涮婵稻谷荒苷T導(dǎo)腫瘤變小甚至消退，并且延緩腫瘤生長(zhǎng)。另外，在對(duì)拓?fù)涮婵抵委熭^敏感的腫瘤中，其持續(xù)性服藥進(jìn)行治療的抗癌活性明顯比進(jìn)行藥物沖擊性治療療效要優(yōu)越。國(guó)內(nèi)有文獻(xiàn)對(duì)移植性探鼠體內(nèi)這種動(dòng)物模型的卵巢癌細(xì)胞進(jìn)行了詳細(xì)細(xì)致的觀察，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)對(duì)探鼠進(jìn)行局部注射拓?fù)涮婵岛?，卵巢癌的腫瘤體積較不進(jìn)行拓?fù)涮婵抵委煹哪[瘤體積變小，用拓?fù)涮婵抵委熀蟮哪[瘤進(jìn)行計(jì)算其抑制率的計(jì)算，結(jié)果可達(dá)75%。

本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了利用MTT法得到的對(duì)細(xì)胞的增殖抑制率，并用抑制率數(shù)據(jù)繪制出了細(xì)胞增殖曲線，通過(guò)上述結(jié)果發(fā)現(xiàn)了拓?fù)涮婵祵?duì)HL-60細(xì)胞具有增殖抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)，化療藥物治療腫瘤的作用力度是和藥物濃度的大小和作用時(shí)間的長(zhǎng)短不可分開(kāi)的，濃度較大時(shí)間也長(zhǎng)的藥物抑制腫瘤作用也強(qiáng)，但毒副反應(yīng)也隨之增多，當(dāng)然抗腫瘤作用也與特定藥物性質(zhì)有密切關(guān)系的。本研究通過(guò)MTT法探討了拓?fù)涮婵祵?duì)HL-60細(xì)胞的增殖抑制的時(shí)間和濃度方面進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。檢測(cè)所得的數(shù)據(jù)顯示：同一時(shí)間點(diǎn)不同濃度的TPT（0.1?mol/L、0.2?mol/L、0.4?mol/L、0.8?mol/L）對(duì)HL-60細(xì)胞的抑制作用，隨著濃度的升高，拓?fù)涮婵档囊种谱饔蔑@得越來(lái)增強(qiáng)。TPT對(duì) HL-60細(xì)胞增殖抑制作用，是其促進(jìn)HL-60細(xì)胞凋亡的結(jié)果，但TPT誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制，仍需進(jìn)一步探討。

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